نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

يبدأ تحليل سلاسل السكر غير المرتبطة في البروتينات السكرية بوضع علامات على الغليكانات والخلايا باستخدام المانوز المسمى بالتريتيوم. يتم تبريد طبق النبض (pulse dish) على الجليد، بينما يتم تحضين طبق المطاردة (chase dish) بدون علامة لمدة المطاردة المطلوبة. بعد ذلك، يتم تحلل العينات وتنقية البروتين السكري المستهدف مناعيًا في حالته غير المطوية، ثم يتم تحرير الغليكانات الخاصة به إنزيميًا.

تُنقى السكريات قليلة التعدد بشكل إضافي عن طريق الترشيح الجزيئي، والذي يفصلها عن البروتينات والملوثات الأخرى التي يزيد حجمها عن 30 kilodaltons. ثم تُفصل الغليكانات باستخدام تقنية HPLC. ويتم تحديد كمية كل شكل من أشكال الغليكان عن طريق قياس شدة الإشارة الإشعاعية في كل جزء مستخلص.

مرحباً، أنا إدوارد أزو من مختبر جيرالدو ليتر كريمر في قسم أبحاث الخلايا وعلم المناعة في جامعة تل أبيب. أنا أيضاً من مختبر جيرالدو ليتر كريمر. وسنعرض لكم اليوم إجراءً لعزل وتحليل السكريات المتعددة المرتبطة والموسومة استقلابياً.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة ديناميكيات معالجة السلاسل السكرية لكل من مجموعات البروتينات السكرية الخلوية الكلية والبروتينات السكرية الفردية. حسنًا، فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، استخدم خلايا NIH three T three التي تم إنماؤها طوال الليل في طبق واحد بقطر 90 مليمتر.

لكل عينة، يجب أن تكون المزرعة في حالة دون تلاحم (sub confluent) لتجويع الخلايا من الجلوكوز. قم بتحضير وسط خالٍ من الجلوكوز بتركيز 2X، مضافاً إليه 20% من مصل الجنين البقري (FCS) المدياليز، و8 millimolar من بيروفات الصوديوم. خفف حجماً واحداً من الكمية المطلوبة من وسط 2X بحجم واحد من الماء منزوع الأيونات. قم بتدفئة الوسط مسبقاً، ثم حضن كل عينة خلوية في 5 milliliters من الوسط الجديد الذي تم تدفئته مسبقاً لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة. إذا كانت هناك حاجة لفترة ملاحقة (chase) تزيد عن 12 ساعة، فيجب التعامل مع الخلايا في ظروف معقمة.

في نهاية فترة التحضين، قم بتمييز الأطباق المقابلة لعينات النبض والمطاردة (pulse and chase). ولوسم الغليكانات النيتروجينية (n glycans) لتحليل البروتينات السكرية عن طريق الترسيب المناعي، استبدل وسط التجويع بـ 1 mL من وسط خالٍ من الغلوكوز ومسخن مسبقاً، ومُدعم بـ 400 micro curies per milliliter من المانوز المسمى بالتريتيوم. استخدم 65 micro curies per milliliter لوسم وتحليل إجمالي البروتينات السكرية.

بعد استبدال وسط التجويع، قم بتحضين الخلايا في ظروف زراعة الأنسجة العادية لمدة ساعة واحدة. وفي نهاية فترة التحضين التي استمرت ساعة، قم بإزالة وسط الوسم من جميع العينات. أضف بعناية 2 mL من PBS عند درجة حرارة 4 °C إلى العينات المقابلة للنبضة (pulse) وضعها على الثلج. يُشار إلى هذه العينات باسم العينات النبضية.

استخدم 2 mL من وسط استزراع كامل عادي مُدفأ مسبقاً لشطف عينات المطاردة ثلاث مرات. بعد ذلك، أضف 5 mL من الوسط العادي المُدفأ مسبقاً إلى الخلايا.

ضع عينات المطاردة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية للفترات الزمنية المطلوبة للمطاردة. وأثناء تحضين عينات المطاردة، اشطف عينات النبض التي تُرِكت على الثلج ثلاث مرات باستخدام 2 mL من محلول PBS البارد جداً. بعد ذلك، استخدم مكشطة خلايا لكشط الخلايا من الطبق.

ضع الخلايا المتحررة في أنبوبة EOR سعة 2 mL تحتوي على 2 mL من محلول PBS. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 16,000 GS لمدة تتراوح من 6 إلى 10 ثوانٍ لفصل المادة الطافية، ثم جمد كتلة الخلايا عند -80 °C. وعند انتهاء فترة تحضين عينات المطاردة، قم بشطفها.

قم بالتدوير والتخزين كما هو موضح للتو بالنسبة لعينات النبض. وبمجرد الاستعداد للمتابعة في تحليل الخلايا، أخرج الخلايا من المجمد. أما بالنسبة لتحليل الـ IP، فقم بتحليل الخلايا بإضافة 300 µL من المنظم.

قم بالرج باستخدام جهاز vortex لفترة وجيزة ثم حضّن المزيج لمدة 20 دقيقة على الثلج. ولتحليل عينات البروتينات السكرية الكلية، أضف 300 µL من buffer B. حضّن الخلايا لمدة 20 دقيقة على الثلج، متبوعة بعملية سونيكة (sonication) لأربع مرات، لمدة 10 ثوانٍ في كل مرة وبأقصى سعة. بعد ذلك، قم بغلي العينات لمدة خمس دقائق.

أخيرًا، قم بطرد جميع المستخلصات مركزيًا عند 16, 000 Gs لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. انقل السائل العلوي إلى أنبوب EOR جديد وتخلص من الراسب. انتقل إلى عملية IP لفحص البروتين المستهدف للترسيب المناعي للبروتين السكري H two A الموضح هنا.

أضف 20 µL لكل عينة من البروتين، A agro speeds، وثلاثة µL لكل عينة من جسم مضاد الأرنب متعدد النسائل anti H two A الخاص بالمختبر إلى المادة الطافية للخلايا المحللة. حضن العينات لمدة تتراوح من 4 إلى 16 ساعة عند درجة حرارة 4 °C، مع الخلط المستمر عن طريق التدوير البطيء. في نهاية فترة التحضين، قم بطرد الخرزات مركزياً لترسيبها وأزل المادة الطافية بعناية باستخدام جهاز شفط، ثم اشطف الخرزات أربع مرات بإضافة 500 µL من المنظم buffer tea.

بعد ذلك، يتم طرد الخرزات مركزياً لترسيبها وإزالة الطافي لتحرير البروتينات المرتبطة بالخرزات. أضف 10 µL من محلول التفكيك (denaturing buffer) من مجموعة Endo H إلى راسب الخرزات، ثم اغْلِ العينات لمدة خمس دقائق. اطرد الخرزات مركزياً وانقل الطافي إلى أنبوب EOR جديد.

أصبحت بروتينات ellu الآن جاهزة لإزالة السكريات. يتم تحرير الغليكانات من كل من عينات IP وعينات البروتين الكلية باستخدام الإنزيم و OH. بالنسبة لعينات IP، أضف 0.5 µL من إنزيم endo H إلى كل عينة بالإضافة إلى 10 µL من منظم تفاعل endo H بتركيز 2x. تُحضن العينات عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات.

بالنسبة للبروتينات السكرية الكلية، يتم وضع الطافي من محللات الخلايا في مرشح MicroCon بحد قطع قدره 30 kilodalton. تُغسل مستخلصات البروتين الكلية ثلاث مرات باستخدام 100 µL من المنظم E عن طريق الطرد المركزي المتكرر عند 14,000 Gs لمدة ثلاث دقائق، ثم يُضاف 3 µL من منظم تفاعل endo H بتركيز 10x، و 1.5 µL من إنزيم endo H إلى MicroCon حيث تظل البروتينات المغسولة، وتُحضن لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C جنباً إلى جنب مع عينات الـ IP.

في نهاية فترة الحضن التي تستمر ثلاث ساعات، يتم تخفيف عينة الـ IP خمس مرات باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم توضع فوق مرشح MicroCon جديد وتُطرد مركزياً عند 14,000 Gs لمدة ثلاث دقائق. يتم بعد ذلك غسل كل من عينات الـ IP والبروتين الكلي عن طريق إضافة 50 µL من الماء منزوع الأيونات وطرد العينات مركزياً، وتكرر هذه العملية مرتين إضافيتين. يتم الاحتفاظ بالراشح الذي يحتوي على الجليكانات المقطوعة إذا لزم الأمر، من خلال الأنابيب التي تحتوي على endo H. بعد ذلك، تُحضن البروتينات السكرية المقاومة لـ endo H مع 200 mU من N glycosidase F في 15 µL من buffer C عند 37 °C لمدة 16 ساعة.

تُجرى عملية الشطف بالماء منزوع الأيونات كما هو موضح تماماً. جفف العينات تماماً باستخدام جهاز تركيز سريع (speed vac) مع التسخين حتى 45 °C لتسريع العملية. أعد تعليق الرواسب الجافة في 12 µL من مذيب HPLC، ثم قم بتحميل العينات على عمود sphe أو عمود amino مثبت في جهاز HPLC.

قم بتشغيل العينات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. اجمع 48 جزءاً لكل تشغيل عينة. استخدم عداد وميضي لقياس قيم CPM للأجزاء التي تم جمعها، ثم مثّل قراءات CPM بيانياً كدالة في رقم الجزء.

احسب النسبة المئوية لبقايا المانوز لجميع أنواع الغليكان كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرفق. فيما يلي نتائج تمثيلية لتحليل السلاسل السكرية لجميع البروتينات السكرية من عينة وسم نبضية لمدة ساعة واحدة. تُمثل قراءة CPM لكسور HPLC كدالة لرقم الكسر في المخطط الناتج.

تمثل كل قمة نوعًا محددًا من الغليكانات التي تم تحديدها بواسطة تشغيل HPLC لمعايير غليكان معروفة. وبالنسبة لكل نوع من الغليكانات، يتم رسم النسبة المئوية المولية من إجمالي الغليكانات كدالة للزمن في تجربة المطاردة (chase). يوضح التحليل المعروض هنا حالة بروتين سكري محدد سيء الطي تم عزله عن طريق الترسيب المناعي من عينة معالجة بمثبط البروتيازوم MG 1 32.

تتراكم أنواع الغليكان المقلمة M five six خلال فترة المطاردة، مما يؤدي إلى استنتاج أن السكريات قليلة التعدد الموجودة على البروتينات ذات الطي الخاطئ تخضع لتقليم مكثف للمانوز قبل تحللها. وهذا يتناقض مع السكريات قليلة التعدد الموجودة على إجمالي البروتينات السكرية من العينات التي عولجت بنفس الطريقة؛ حيث تظل M nine eight هي أنواع الغليكان الرئيسية خلال المطاردة، مع زيادة طفيفة فقط في كمية M five six. ويؤدي هذا إلى استنتاج أن جزءاً صغيراً فقط من إجمالي تجمع البروتينات السكرية يتم توجيهه إلى عملية تحلل البروتينات المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية.

اختصار rad. كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول المكتوب المرفق، لقد عرضنا للتو كيفية استخدام مزيج من palase في الخلايا الحية وتحليل HPLC لمتابعة ديناميكيات تكوين السكريات قليلة التشاكل غير المرتبطة خلال عمر البروتين السكري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب تلوث عينات المطاردة (chase samples) بآثار من المواد المشعة، وهو ما سيؤدي إلى وسم غير مرغوب فيه للغليكانات خلال فترات المطاردة أثناء الفصل حسب الحجم.

ومن المهم أيضاً ضبط جهاز HPLC على ضغط ثابت لضمان اتساق تجزئة الغليكانات. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.