SDS-PAGE/Immunoblot الكشف عن Multimers Aβ في الأنسجة البشرية القشرية الخليط باستخدام مستضد استرجاع حاتمة

يتيح هذا البروتوكول الكشف عن بيتا مالترز في أنسجة القشرة البشرية. أولاً، يتم تعريض الأنسجة المتجانسة للموجات فوق الصوتية المسبارية وتنقيتها عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة. بعد ذلك، تُغلى عينات من المختزل في محلول SDS المنظم ثم تُحمل على هلام البولي أكريلاميد.

يتم نقل بروتينات الهلام إلى غشاء نيتروسليلوز، ثم يُسخن الغشاء بالبخار في محلول ملحي منظم بالفوسفات. وأخيراً، وباستخدام هزاز مداري، يُحضن الغشاء طوال الليل في جسيم مضاد أولي، ثم في جسيم مضاد ثانوي مقترن بـ HRP، ثم في كاشف بيروكسيد لومينال قبل التعريض لفيلم الأشعة السينية. مرحباً، أنا ريبيكا روزن من مختبر لاري ووكر في قسم علوم الأعصاب بمركز ييركس الوطني لأبحاث الرئيسيات في جامعة إيموري.

سنوضح لكم اليوم كيفية الكشف عن مجمعات Abeta والمتجانسات القشرية باستخدام الفصل الكهربائي لهلام SDS واللطخة المناعية مع استعادة المستضد المحفزة حرارياً. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة مستويات وتوزيع مجمعات Abeta المتميزة في الأنسجة القشرية غير المثبتة من البشر المصابين بمرض الزهايمر والرئيسيات غير البشرية المتقدمة في السن. لذا، لنبدأ الآن.

ابدأ بحوالي مائة مليجرام من النسيج القشري غير المثبت وقم بتجنيسه في حوالي 400 µL من محلول منظم بارد جداً باستخدام حوالي 30 ضربة متساوية بالمدقة. ولتحقيق تركيز 20% وزن/حجم، يجب أن تكون نسبة وزن النسيج إلى حجم المحلول المنظم هي 1 mg إلى 4 µL. بعد التجنيس، انقل المجانسات إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 4 mL وقم بإجراء السونكة بالمسبار ثلاث مرات، كل مرة لمدة 5 ثوانٍ عند القدرة 5.

بعد عملية السونيكة (sonication)، يتم نقل المتجانسات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter ويتم تدويرها لمدة خمس دقائق عند 3000 G، ثم تُزال السوائل الطافية الرائقة بعناية وتُخزن حصص مقدارها 50 microliter من هذه المستخلصات عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius حتى وقت الاستخدام. بعد ذلك، يتم تحديد تركيز البروتين الكلي للحصص المذابة حديثاً من المتجانسات الرائقة باستخدام مقايسة bio acid أو BCA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة؛ حيث يجب أن يكون تركيز البروتين في المتجانسات القشرية الرائقة بنسبة 20% أكبر من five micrograms per microliter، وبالتالي يمكن تخفيفها بنسبة 1 to 10 لتكون ضمن نطاق قراءة جهاز قارئ الأطباق. وبالنسبة لمقايسة BCA، يتم تحضير تفاعلات العينات المسوّاة (denaturing sample reactions) باستخدام نفس الحصص من المتجانسات الرائقة.

استخدم ما يقرب من 50 إلى 60 ميكروغرام من البروتين الكلي وقم بتعديل حجم متجانسات القشرة الدماغية وفقًا لذلك، بحيث يحتوي كل منها على نفس الكمية من البروتين الكلي. قم بتحضير العينات ليصل الحجم الإجمالي إلى 25 ميكرولتر لكل جل trice بنسبة 10 إلى 20% سيتم تشغيله. وبالنسبة لكل جل، قم بتحضير ضابط موجب يتكون من 10 إلى 100 نانوغرام من ببتيد synthetic a beta 40 أو a beta 42 مخفف في 1X PBS إلى 10 ميكرولتر مع 12.5 ميكرولتر من 2X SDS sample buffer، و 2.5 ميكرولتر من 10x reducing agent.

بعد تحضير جميع العينات، بما في ذلك عينة التحكم السالبة (beta control)، يتم رجها باستخدام جهاز الدوامة (vortex) لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 ثوانٍ، ثم تسخينها في حمام جاف عند 100 درجة Celsius لمدة خمس دقائق، ثم تدوير جميع الأنابيب بسرعة لإزالة التكثف من الغطاء. تُحمل العينات على هلام (gel) مغمور في منظم تشغيل SDS ثلاثي (trice SDS running buffer) داخل صندوق الهلام، مع تحميل بئر واحد على الأقل بـ 10 µL من مؤشر الوزن الجزيئي غير المخفف. يتم تشغيل الهلام بجهد ثابت قدره 125 volts لمدة 90 دقيقة تقريباً أو حتى يصل مؤشر 4 kilo Dalton إلى مسافة سنتيمتر واحد تقريباً من أسفل الهلام.

أخرج الهلامات بعناية من الحافظات البلاستيكية وقم بتجميع شطيرة النقل وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بترطيب وسادات النقل وأغشية النيتروسليلوز ذات المسامية الميكرومترية مسبقاً باستخدام محلول التخزين tris glycine. أضف محلول النقل (Transfer buffer) وأزل أي فقاعات هوائية من وسادات النقل أو شطيرة غشاء ورقة الترشيح.

املأ الحجرة الداخلية لجهاز النقل بمحلول نقل (transfer buffer) واملأ الحجرة الخارجية بالماء المقطر. قم بتشغيل عملية النقل لمدة تتراوح بين ساعتين وثلاث ساعات بتيار كهربائي ثابت قدره 25 milliamps. عند اكتمال عملية النقل، قم بتفكيك "الساندويتش" وضع الهلامات (gels) في وعاء مملوء بالماء المقطر والأغشية في وعاء مملوء بـ 1X PBS لجميع خطوات البروتوكول.

تأكد من تغطية الهلامات والأغشية بالكامل بالسائل لتجنب الجفاف. ولتصوير كفاءة نقل البروتين، يتم صبغ الهلامات بصبغة simply blue safe غير المخففة لمدة حضانة تبلغ حوالي ساعة واحدة، والأغشية بصبغة PON S red بتركيز 1x لمدة خمس دقائق تقريباً. تكون مدة الحضانة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ولن يتداخل هذا التلوين مع عملية اللطخة المناعية (immuno blotting).

إذا كشف التلوين عن عدم كفاءة في نقل البروتين، فقم بتعديل وقت النقل في الخطوة الثالثة لاستعادة المستضد. في جهاز البخار، قم بإغلاق الغشاء حرارياً داخل كيس بلاستيكي متين من نوع CapEx مملوء بنحو 50 milliliters من 1X PBS في درجة حرارة الغرفة. ضع الكيس بشكل مسطح في جهاز بخار مسخن مسبقاً عند 100 درجة Celsius، وبمجرد أن يبدأ الكيس في التمدد، قم بالتحضين لمدة 15 دقائق إضافية قبل إخراجه من جهاز البخار.

اترك الغشاء ليبرد ببطء قبل إخراجه من الكيس لمنع حدوث تجاعيد مفرطة في درجة حرارة الغرفة. أخرج الغشاء بعناية من الكيس واغسله لمدة خمس دقائق باستخدام XPBS على هزاز مداري، يليه شطف لمدة خمس دقائق في TBST على هزاز مداري. بعد ذلك، قم بتحضين الغشاء في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة على هزاز مداري دون شطف، ثم انقل الغشاء إلى وعاء يحتوي على الأجسام المضادة الأولية six E 10، النوعية لـ A beta والمنطقة الطرفية، والمخففة بنسبة من 1 إلى 1000 إلى 1 إلى 5,000 في محلول الحجب.

يُحضّن على هزاز مداري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم لمدة 24 إلى 48 ساعة مع الرج في درجة حرارة 4 °C. وبعد إجراء عملية شطف سريعة واحدة، يُغسل الغشاء لمدة 30 دقيقة في محلول TBST، يليه ثلاث عمليات شطف لمدة 10 دقائق على هزاز مداري.

قم بحضن الغشاء في جسم مضاد ثانوي مقترن بـ HRP ومخفف بنسبة 1 إلى 10,000 في محلول الحجب لمدة 90 دقيقة على جهاز الرج في درجة حرارة الغرفة. في هذا البروتوكول، نستخدم جسماً مضاداً لـ US من أغنام. مرة أخرى، اغسل الغشاء لمدة 30 دقيقة في TBST، بدءاً بغسلة واحدة سريعة تليها ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق لكل منها على جهاز رج مداري.

بعد عملية الشطف الأخيرة، يتم تحضين الغشاء في كواشف super signal West Pico ECL غير المخففة والمحضرة حديثاً لمدة خمس دقائق. وأثناء وجوده على الهزاز بسرعة دوران عالية (RPM)، يتم إخراج الغشاء والتخلص من الكاشف الزائد. وباستخدام ورق ترشيح خالٍ من الوبر أو مناديل Kim wipes، يوضع الغشاء في كاسيت فيلم بين واقيات من الصفائح البلاستيكية، ثم يتم تجفيف ما تبقى من كاشف super signal باستخدام مناديل Kim wipes الخالية من الغبار.

إذا لزم الأمر، يتم التعريض لفيلم Kodak Biomax MR لفترات زمنية تبلغ 30 ثانية، وصولاً إلى 30 دقيقة، ثم يتم التحميض في محلول تحميض الأفلام. بعد خمس دقائق، من المرجح أن تصبح حزم A beta monomer مشبعة في هذه التجربة. تم تحليل مُجانسات مُصفّاة تحتوي على 50 micrograms من البروتين الكلي من سبعة أشخاص لتقصي وجود beta amyloid متعدد القسيمات أو A beta والبروتين السلائف للأميلويد أو APP، وهو البروتين عبر الغشائي الذي ينشق منه ببتيد A beta.

نعرض هنا صوراً تمثيلية من تجربة لطخة ويسترن لبروتينات A beta و a PP عند تعريض لمدة 30 دقيقة وخمس دقائق. يتيح التعريض لمدة 30 دقيقة رؤية نطاقات A beta ذات الوزن الجزيئي الأخف بكثير مثل الثنائيات (dimer)، والثلاثيات (trier)، والرباعيات (tetramer)، والنطاقات ذات الوزن الجزيئي الأعلى أو المتجمعة (ligament)، ولكن هذا يؤدي إلى تعريض مفرط للمسارات الأخرى مقارنة بوقت التعريض البالغ خمس دقائق. يظهر نفس نطاق الرباعيات في حالة التعريض القصير ولكنه يكون باهتاً، مما يسمح برؤية المسارات الأخرى بوضوح.

تظهر متجانسات القشرة الدماغية من أشخاص مصابين بمرض Alzheimer's في الممرات من واحد إلى ثلاثة، ويظهر في الممر الرابع شخص بشري تم تشخيصه بمرض dementia with Lewy bodies أو DLB ومرض Alzheimer's، بينما تظهر حالات dementia with Lewy bodies في الممرين الخامس والسادس، وحالة ضابطة لشخص بشري مسن غير مصاب بالخرف في الممر السابع. وقد كشف التحليل المناعي (immuno blotting) باستخدام الجسم المضاد 6C10 عن وجود مونومرات، ودايمرات، وترايمرات، وتتراميرات، وأوليغومرات Aβ في جميع حالات Alzheimer's، بالإضافة إلى وفرة في Aβ ذات وزن جزيئي أعلى في حالتين من حالات AD، وهو ما يشير إلى عدم التجانس في عملية Aβ ization بين الأشخاص البشر.

يؤكد وجود beta 40 في المسار الأيمن هوية الحزم ذات الوزن الجزيئي المنخفض. لقد عرضنا لكم للتو تجربة Western blot باستخدام SDS-PAGE لتحديد multimers beta في متجانسات نسيجية غير مثبتة من أدمغة بشر مصابين بأمراض التنكس العصبي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحضير متجانسات قشرية عالية التركيز للفصل بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي من أجل الكشف عن Abeta malters ذات الوفرة المنخفضة.

من المهم أيضاً إجراء عملية استعادة مستضدات الحواشي المستحثة حرارياً قبل إجراء البصمة المناعية باستخدام جسم مضاد للببتيد Abeta. تساعد عملية استعادة المستضد في الكشف عن حواشي Abeta المحجوبة لضمان الارتباط الأمثل للجسم المضاد أثناء البصمة المناعية. ويكفي استخدام أي جهاز تبخير أو ميكروويف أو حمام مائي يحافظ على درجة حرارة 100 °C.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.