حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل ومقارنة المنطقة الأحادية والكسور متعددة الريبوسوم من محللات الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا ذات الأهمية أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي تحضير محللة الخلية.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي الطرد المركزي للمحللات من خلال تدرج السكروز. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تجزئة التدرج وتصور مجموعات الريبوسومات المختلفة من خلال تتبع الأشعة فوق البنفسجية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغييرات في الترجمة في ظل ظروف تجريبية مختلفة من خلال تحليل ملف تعريف بولي ريبوسوم.

مرحبا ، أنا أنتوني إسبوزيتو من مختبر الدكتور تيري جوس كينزي في قسم علم الوراثة الجزيئية وعلم الأحياء الدقيقة والمناعة في كلية الطب UMD و J Robert Wood Johnson. وأنا ماركوس لويس. أيضا من مختبر ماكينزي هنا في R-W-J-M-S.

سنعرض لكم اليوم إجراء لتحليل بولي ريبوسوم. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التغيرات وتخليق البروتين التي تنشأ عن الطفرات أو العوامل البيئية. لذلك دعونا نبدأ. سكروز.

يجب تحضير التدرجات قبل يوم واحد من الاستخدام للسماح للتدرجات بأن تصبح مستمرة. امزج الأحجام المناسبة من محاليل مخزون السكروز 7٪ و 47٪ لعمل 48 مل من كل تركيز من تركيزات السكروز التالية ، 7٪ 17٪ 27٪ 37٪ و 47٪ أضف DTT موليا واحدا لكل محلول سكروز إلى تركيز نهائي يبلغ ملليموليا واحدا. من أجل صب التدرجات ، قم بتوصيل ماصة المعكرونة بحقنة سعة 20 مليلتر عن طريق تثبيتها وإغلاقها بغشاء بارا.

أضف سبعة ملليلتر من 7٪ سكروز إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق بولي عامر بوصة واحدة × 3.5 بوصة. بعد ذلك ، أضف سبعة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 17٪ تحت محلول 7٪ عن طريق وضع طرف ماصة المعكرونة بالقرب من قاع ماصة الأنبوب ببطء. يجب أن يستغرق صب كل طبقة ما لا يقل عن 20 ثانية.

كرر مع سبعة ملليلتر لكل من محاليل 27٪ 37٪ و 47٪ سكروز عندما يكون التدرج يشعر بالملل. يجب أن تلاحظ خطوطا واضحة بين الطبقات تشير إلى حدوث الحد الأدنى من الخلط. قم بتخزين جميع التدرجات التي تكون أربع درجات مئوية طوال الليل ، جنبا إلى جنب مع الدوارات والزجاجات والأنابيب التي سيتم استخدامها لحصاد العينات.

لتحضير مقتطفات من خلايا الخميرة ، ابدأ بزراعة مائة 25 مل من ثقافة الخميرة إلى OD 600 من 0.8 إلى واحد. أضف cyclo heide إلى المزرعة إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكروغرام لكل مليلتر واستمر في الاهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، اسكب المزرعة في زجاجة طرد مركزي سعة 250 مليلتر واملأها بالثلج.

احتفظ بكل شيء على الجليد من هذه النقطة فصاعدا ، فإن أجهزة الطرد المركزي عند 8000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. Resus ، قم بتعليق الحبيبات في 10 مل من الثلج ، والتحلل البارد ، والمخزن المؤقت ، ونقلها إلى 15 أنابيب بولي بروبيلين ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 5 ، 900 مرة من الجاذبية لمدة ثلاث دقائق من أربع درجات مئوية Resus.

قم بتعليق الحبيبات في 0.5 مل من المخزن المؤقت للتحلل. انقل التعليق إلى أنبوب فوج دقيق سعة 1.5 مليلتر ثم أضف 0.5 مل من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض المبرد. دوامة الخلايا لأربع فترات 32 ، واستدعاء الأنبوب على الجليد لمدة 30 ثانية بين كل فاصلة.

ثم أضف 0.5 مل أخرى من المخزن المؤقت للتحلل في جهاز الطرد المركزي الأنبوبي سعة 1.5 مليلتر عند 5,000 مرة. الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

أخيرا ، انقل supinate إلى أنبوب مركزي صغير جديد سعة 1.5 ملليلتر. يمكن تخزين المستخلص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لنقل المحللة إلى تدرج السكروز. ضع طرف الماصة على جدار الأنبوب بالقرب من سطح التدرج وقم بوضع طبقة من المحللة برفق فوق التدرج.

للحصول على تدرج 35 مليلتر ، يتم عادة تحميل 500 ميكرولتر من المحلل. باستخدام الملقط ، قم بخفض التدرج بعناية في دلو دوار دلو متأرجح. الطرد المركزي التدرجات عند 100،000 مرة من الجاذبية لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية.

قبل حوالي 30 دقيقة من الانتهاء من الدوران الذي استغرقه أربع ساعات. قم بتوصيل الإبرة بثقب الأنبوب وقم بتوصيل القلم بجهاز مراقبة التألق عبر الإنترنت. قم بتشغيل طاقة جهاز مراقبة الامتصاص للسماح بالوصول إلى خط أساس مستقر قبل تحليل العينات.

يمكن بسهولة الحصول على الاستحواذ الإلكتروني على ملف تعريف PolyZone في الوقت الفعلي عن طريق إرفاق وحدة الحصول على البيانات DI 1 48 U. إلى مسجل الرسم البياني ، املأ مضخة الحقنة ب 50 مل من صواميل الفلورين باستخدام إعداد التدفق العكسي السريع. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء.

قم بتوصيل الخرطوم من المحقنة بثقب الأنبوب. وقم بتشغيل تدفق Flo الخامل لفترة وجيزة بمعدل ستة ملليلتر في الدقيقة في الاتجاه الأمامي. لتنظيف الخرطوم من أي فقاعات هواء ، ضع سلسلة من الأنابيب أسفل الخرطوم في نهاية خلية التدفق لجمع عينة من جريان السطح.

قم بإعداد دلو ثلج بئر مشكل مسبقا لتثبيت أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على تدرج السكروز. عند اكتمال الطرد المركزي لمدة أربع ساعات ، قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي بعناية من دوار أجهزة الطرد المركزي وضعها على الجليد. الحرص على تجنب إزعاج التدرجات.

لتحليل مستخلصات الخلايا ، ضع أنبوب التدرج على ثقب الأنبوب وقم بتوصيل الجزء العلوي من الأنبوب بالمخرج وتأمينه. ارفع المرحلة السفلية إلى أنبوب الطرد المركزي بحيث تخترق الإبرة قاع الأنبوب. ابدأ تدفق تنبيه فلورين في الاتجاه الأمامي بمعدل ستة ملليلتر في الدقيقة.

بمجرد أن يبدأ الفلوت في التدفق إلى الأنبوب ، راقب حركة الإبرة على جهاز مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عبر الإنترنت. بمجرد أن تبدأ الإبرة في التحرك ، قم بتشغيل حركة الرسم البياني إلى إعداد السرعة 60. عند الوصول إلى نهاية ملف تعريف بولي الريبوسوم ، قم بإيقاف تشغيل تدفق Flo الخامل إلى أنبوب الطرد المركزي وإيقاف حركة الرسم البياني عند شاشة مضان الامتصاص.

اسحب خامل Flo من أنبوب الطرد المركزي إلى المحقنة عن طريق بدء التدفق في الاتجاه العكسي بمعدل سريع ، مع التأكد من عدم سحب السكروز من الأنبوب إلى المحقنة. قم بفك أنبوب الطرد المركزي من ثقب الأنبوب ، وقم بخفض الإبرة وإزالة الأنبوب. يظهر هنا أثر تمثيلي لمستخلص الريبوسوم المحضر من الخميرة في وجود cyclo heide.

يشار إلى قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية التي تحتوي على بوليبوزومات و A TS 60 ثانية و 40 ثانية ريبوسومات. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تحليل بولي ريبوسوم عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر العمل بسرعة ، مع الحفاظ على العينات باردة وخالية من الحمض النووي الريبي.

هذا كل شيء. شكرا للمشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.