الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد الأهداف الجينومية ل KDM خمسة وجاريد واحد ، و RBB اثنين من هيستون ديميثيلاز. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الكروماتين المتشابك الذي يتم صوتنة لإنتاج شظايا الحمض النووي بالحجم المناسب كخطوة ثانية. RBB اثنان من شظايا الحمض النووي مرتبطة هي مناعية مع RBB اثنين من الأجسام المضادة.

بعد ذلك ، يتم تضخيم الحمض النووي الجيني المستعاد بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للتسلسل. أخيرا ، تتماشى القراءات القصيرة المتسلسلة من Illumina بشكل فريد مع الجينوم البشري ، ويتم تحديد القمم المهمة والتعليق عليها لأقرب الجينات. من أجل تحديد rbbb ، تم الحصول على جينين مستهدفين يظهران الوظائف الجزيئية المرتبطة ب Rrb B وهما جينان مستهدفان يستندان إلى تحديد الجينوم على مستوى الجينوم ل Rbbb منطقتين مخصبتين.

مرحبا ، أنا مايك. هي من مختبر الدكتورة إليزابيث بينسيا في قسم الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة الجزيئية بجامعة إلينوي في شيكاغو. وأنا علاء من مختبر علم الجينوم الطبي الحيوي بقيادة الدكتور NGA في جامعة BARCEL Biomedical Research Park PO P fea.

وأنا دانييل دال. وأنا ويليام ريختر. كلانا أيضا في مختبر مهارات الإحسان.

سنعرض لكم اليوم إجراء للكروماتين والترسيب المناعي والتسلسل. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة موقع ربط طبيب الأمراض الجلدية. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، تنمو ما يقرب من 10 إلى الخلايا الثامنة. لكل ترسيب مناعي أو ip. هنا ، سرطان الغدد الليمفاوية الانحلال للعظم المنتشرة.

استخدام خلايا U 9 37 وتحفيزها للتمايز أحادي الخلية باستخدام TPA لمدة 96 ساعة بعد نمو الخلية في محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى الوسائط إلى تركيز نهائي قدره 1٪ ثم قم بتدوير القارورة لفترة وجيزة واتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم استنشق الوسائط واشطف الخلايا ب 15 مل من PBS المثلج. كرر هذا الغسيل مرة واحدة.

بعد ذلك ، أضف ستة ملليلتر من محلول التحلل واحد لكل من القوارير الموجودة على الجليد. ثم هز القوارير لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أخيرا ، قم بحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية ونقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا.

في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. إذا تم تجميد الخلايا ، فقم بإخراجها. بمجرد إذابتها ، قم بتدوير الخلايا لأسفل وتخلص من snat.

ثم أعد تعليق الخلايا في ستة ملليلتر من محلول التحلل الثاني ، وهز الأنابيب برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. كرر الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في 2.5 مل من محلول التحلل ثلاثة. بعد ذلك ، قم بإعداد التعليق للصوتنة عن طريق وضعه في دورق من الماء الجليدي مع ضبط الطرف الجزئي لسونير برانسون 450 على ما بين 50 و 60٪ السعة.

قم بالاتصال بالمحلول للحصول على انفجار ثابت 32 وتبرد على الجليد. لمدة دقيقة واحدة ، كرر هذه النبضات من 10 إلى 15 مرة ، ثم قم بسحب محتويات الأنبوب لأعلى ولأسفل وانقلها إلى أنبوب جديد. استمر في نبض المحلول وتبريده.

خمس مرات إضافية بعد الصوتنة ، أضف 10٪ Triton X 100 إلى واحد من 10 من حجم الحل. ثم انقل المحللات إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر ، وقم بتدوير الحطام في جهاز طرد مركزي دقيق قبل الكروماتين أو الترسيب المناعي أو الرقاقة. حفظ 50 ميكرولترا من محللة الخلية كعينة إدخال.

ثم قم بدمج محللة الخلية التي تم تطهيرها مع حبات دينا المرتبطة بالجسم المضاد الذي تم تحضيره مسبقا كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. هز الخليط بالإضافة إلى عينة الإدخال 50 ميكرولتر عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اغسل الخرزات بمليلتر واحد من محلول الغسيل.

ثم استخدم حاملا مغناطيسيا لجمع الخرز وإزالة المادة الطافية. كرر هذا الغسيل من ست إلى ثماني مرات. قم بإجراء غسيل نهائي بملليلتر واحد من TE بالإضافة إلى 50 مللي مولار كلوريد الصوديوم.

قم بتدوير الخرزات في جهاز طرد مركزي صغير بعد الطرد المركزي ، واستنشق أي عازلة TE متبقية. ثم أضف 100 ميكرولتر من elu buffer إلى العينات. فور.

احتضان العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. خدش الأنابيب مقابل 1.5 ملليلتر أنبوب التثبيت كل دقيقتين للحفاظ على الخرزات في حالة تعليق. اجمع الخرزات باستخدام الطرد المركزي والحامل المغناطيسي وانقل SNAT إلى أنبوب PCR.

ثم استرجع عينة الإدخال المحفوظة مسبقا وأضف ثلاثة مجلدات من المخزن المؤقت للشطف. أخيرا ، ضع IP وعينات الإدخال في جهاز التدوير الحراري طوال الليل عند 65 درجة مئوية. لعكس الروابط المتقاطعة في اليوم التالي، أضف حجما واحدا من المخزن المؤقت TE إلى العينات.

ثم أضف الحمض النووي الريبي A إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر. احتضان العينات في الدراجة الحرارية لمدة ساعة إلى ساعتين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف البروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر.

ثم احتضان العينات في جهاز التدوير الحراري عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، استخرج العينات مرة واحدة بحجم واحد من الفينول. استخرج العينات مرة ثانية بحجم واحد من كحول إيزوأميل كلوروفورم فينيل.

أخيرا ، استخرج العينات مرة أخرى بحجم واحد من كحول الكلوروفورم إيزوأميل. ثم أضف 30 ميكروغراما من الجليكوجين إلى كل عينة. أضف أيضا كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 0.2 مولار ومجلدين من الإيثانول إلى العينات.

احتضنها لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد الحضانة ، قم بتدوير العينات وصب snat. اغسل الكريات ب 500 ميكرولتر من 75٪ إيثانول ، ثم جفف الكريات وأعد تعليقها في 40 ميكرولتر من الماء.

للتحقق من أحجام شظايا الحمض النووي الناتجة عن إجراء SONICATION ، قم بتحميل خمسة ميكروغرامات من عينة الإدخال المنقاة في هلام زراعي بنسبة 1.8٪ وقم بتشغيل الجل. يجب أن ينتج إجراء الصوتنة شظايا في حدود 150 إلى 350 زوجا أساسيا. ومع ذلك ، إذا كانت الشظايا لا تقع في هذا النطاق ، فيجب تعديل إجراء الصوتنة عن طريق تغيير عدد الرشقات والسعة قبل تضخيم الحمض النووي الجيني.

تحقق من حجم العينات وتركيزها وإثرائها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لبدء تضخيم الحمض النووي الجيني ، احصل على 34 ميكرولترا من عينة IP و 200 نانوجرام من عينة الإدخال. قم بإجراء وإصلاح إضافة وربط المحولات بشظايا الحمض النووي باستخدام مجموعة إعداد عينة الحمض النووي الجينومية من Illumina كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية صغيرة من لوت PCR ثم قم بإزالتها في EB العازل الذي تم تسخينه مسبقا إلى 50 درجة مئوية. استخدم 23 ميكرولترا و 46 ميكرولترا لعينات IP وإدخال الحمض النووي على التوالي. قم بعمل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام 23 ميكرولترا من الحمض النووي مع محولات 25 ميكرولتر من الانصهار ، بوليميراز الحمض النووي من المجموعة.

ميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار وحيد PCR واحد وميكرولتر واحد من 20 ميكرومولار. لذلك يقوم تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني بتشغيل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل ذات الحلقة المصغرة Qiagen.

قم بتسخين 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت EB إلى 50 درجة مئوية وقم بتخفيف الحمض النووي 0.5 ميكرولتر من العينة من واحد إلى أربعة وإجراء قراءة NanoDrop لتنقية المنتجات المضخمة. قم بإعداد جل AGROS بنسبة 1.8٪ سعة 50 مل باستخدام ماء بدرجة HPLC ، وأضف TAE إلى البروميد بعد ذوبان agros. ثم صب الجل ، قم بتحميل الجل.

بعد إضافة أربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل إلى عينات الإدخال و IP ، قم بتشغيل الجل عند 120 فولت لمدة 45 دقيقة. قم بتحليل الجل بعد تشغيله. يجب أن يكشف أنه يتم إنتاج شظايا في النطاق بين 150 و 350 زوجا أساسيا.

إنها تمثل شظايا الحمض النووي الجينومي يتراوح طولها بين 50 و 250 زوجا أساسيا. ويقوم المحول باستئصال منطقة الجل التي تحتوي على المادة في نطاق زوج أساسي من 150 إلى 350 باستخدام مشرط. احرص على تجنب استئصال نطاق محول المحول ، والذي يعمل عند حوالي 120 زوجا أساسيا.

استرجع الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام قوارب الكاياك السريع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. جفف العينة إلى 11 ميكرولترا بدقة في سرعة العودة دون حرارة. قم بإزالة ميكرولتر واحد من العينة وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop.

أخيرا ، حدد المنتجات الجينية المخصبة باستخدام محلل الجينوم Illumina وقم بتحليل مواقع الارتباط والجينات المستهدفة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يتم تقديم الإحداثيات الجينومية لبروتين ربط RB المخصب المحدد اثنين أو RBP منطقتين مرتبطتين بتنسيق حكيم للكروموسوم. يمكن تصور إشغال جينات المجموعة في الكروموسومات على أنها VARs سوداء.

هنا يتم عرض إشغالات الكروموسوم 10 rbp ، يتم عرض منطقتين للربط كخطوط رأسية. تظهر اللوحة الوسطى جميع منطقتي ربط rbp على الكروموسوم 10 ، وتظهر اللوحة السفلية rbp منطقتين كبيرتين للربط المتساوي. تقدم هذه المعلومات نظرة عامة على التداخل والإشغال المحدد لشكلين إسويين RBP على الكروموسوم 10.

هنا تظهر خريطة حرارية بمعدل اكتشاف خاطئ أو FDR المصحح بشكل كبير من الأنطولوجيا الجينية المخصبة بشكل كبير أو الانتقال إلى فئات الوظائف الجزيئية بين الجينات المرتبطة ب rbp. يشير لونان باتجاه الأحمر إلى أهمية إحصائية عالية. يشير اللون الأصفر إلى دلالة إحصائية منخفضة ، ويشير اللون الرمادي إلى عدم وجود دلالة إحصائية.

يظهر تحليل التخصيب الوظائف الجزيئية المتداخلة والمتساوية الخاصة ب R BP وهما جينان مستهدفان. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحديد مواقع ربط عامل النسخ أثناء هذا الإجراء. من المهم إنتاج شظايا الحمض النووي بنطاق الحجم والعائد المناسبين.

يمكن تحقيق ذلك باتباع إرشاداتنا أثناء خطوة SONICATION. هذا كل شيء. حظا سعيدا في تجاربك وشكرا على المشاهدة.