حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن محلول في التجويف الصفاقي لسمكة الزيبرا البالغة. في هذا المثال، سنقوم بحقن الجلوكوز في مختبرنا. ونستخدم هذا الإجراء لدراسة استتباب جلوكوز الدم.

يتم تحقيق ذلك من خلال وزن السمكة أولاً لتحديد كمية المحلول التي يجب حقنها لكل جرام من وزن الجسم. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تخدير السمكة باستخدام الماء البارد. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي نقل السمكة إلى منصة المجهر وإجراء عملية الحقن.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في إعادة السمكة إلى حوضها للتعافي. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في استتباب الجلوكوز من خلال قياس مستويات جلوكوز الدم. مرحباً، أنا ماري كينكل من مختبر فيكتوريا برينس في قسم بيولوجيا وتشريح الكائنات الحية بجامعة شيكاغو.

أنا ستيفاني إيمز، من مختبر برينس أيضاً. سنعرض لكم اليوم إجراءً للحقن داخل الصفاق في أسماك Zebrafish البالغة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تنظيم الاستتباب الغلوكوزي في الدم.

لنبدأ الآن. لتحضير الأسماك للحقن، ابدأ بنقل الأسماك إلى حوض نظيف وصُم الأسماك عن الطعام لمدة 24 ساعة لإفراغ محتويات البصيلة المعوية، ولمدة 72 ساعة لخفض مستوى جلوكوز الدم إلى المستويات المرجعية.

الكثافة المستخدمة في هذا البروتوكول هي من 10 إلى 12 سمكة من مجتمع مختلط الجنس لكل حوض سعة تسعة لترات مع ثلاث طبقات من الرخام؛ حيث يعمل الرخام على عزل البيوض لمنع افتراسها. يتم إزالة البيوض والفضلات يومياً عن طريق سحب المياه من الحوض.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول ملح كورتلاند (Cortland salt solution) باستخدام 124.1 millimolar من كلوريد الصوديوم، و5.1 millimolar من كلوريد البوتاسيوم، و2.9 millimolar من بيروفوسفات الصوديوم، و1.9 millimolar من كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدرات، و1.4 millimolar من كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات، و11.9 millimolar من بيكربونات الصوديوم، وأربعة جرامات من بولي فينيل بيروليدون، و1000 USP units من الهيبارين، مع استكمال الحجم النهائي إلى 100 milliliters باستخدام الماء منزوع الأيونات، ثم قم بالفلترة والتعقيم والتخزين عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أذب خمسة جرامات من الجلوكوز في 10 milliliters من محلول ملح كورتلاند لتحضير محلول جلوكوز بتركيز 0.5 mg/µL، ثم قم بالفلترة والتعقيم والتخزين عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، قم بتجهيز طاولة الجراحة عن طريق قطع إسفنجة ناعمة لتصل إلى ارتفاع 20 millimeter تقريبًا من الوجه المسطح. قم بعمل قطع بعمق يتراوح بين 10 إلى 15 millimeter لتثبيت السمكة أثناء الحقن. ضع الإسفنجة داخل طبق Petri dish بقطر 60 millimeter، ثم ضع طبق Petri dish الذي يحتوي على الإسفنجة داخل غطاء صندوق رؤوس الماصة P 200 pipette tip box.

بعد ذلك، قم بتجهيز المجهر عن طريق تغطية قاعدة المجهر بغلاف بلاستيكي ومناشف ورقية للحماية. وفي حالة حدوث انسكابات، ضع طاولة الجراحة فوق المنشفة الورقية. قم بضبط التركيز مسبقاً من خلال عرض طاولة الجراحة والتركيز على الإسفنجة.

ضع إصبعك فوق الإسفنجة وركز عليه لتقليل الحاجة إلى مزيد من ضبط التركيز البؤري عندما تكون السمكة على طاولة الجراحة. بعد ذلك، قم بوزن السمكة عن طريق ملء دورق سعة 500 milliliter بحوالي ثلث حجمه من مياه منشأة تربية الأسماك. انقل السمكة الموجودة في الشبكة إلى الدورق مع تقليل كمية المياه الزائدة قدر الإمكان، ثم سجل الوزن وانقل كل سمكة تم وزنها إلى خزان شفاف ومحدد بملصق.

احسب حجم الحقن بناءً على الوزن. في هذا المثال، سنقوم بحقن محلول من الجلوكوز المذاب في محلول ملح كورتلاند بتركيز 0.5 milligrams لكل gram من وزن الجسم. وبما أن تركيز محلولنا هو 0.5 milligrams لكل microliter، فإن العملية الحسابية هي: 1 مضروباً في وزن السمكة بالـ grams يساوي حجم الحقن بالـ microliters؛ قم بتجهيز المحقنة ومعدات الحقن ذات الصلة.

يستخدم هذا البروتوكول إبرة فولاذية مشطوفة بقياس 30 5G، ومضخة فائقة الدقة (ultra micro pump)، ومعالج micro four، ومحقنة دقيقة nano fill سعة 10 ميكرولتر لحقن الجلوكوز؛ قم بتعبئة المحقنة بـ 0.5 مليجرام لكل ميكرولتر من الجلوكوز المذاب في محلول ملحي من نوع Cortland. من المهم إزالة جميع فقاعات الهواء من المحقنة، ثم قم بتركيب المحقنة على المضخة فائقة الدقة وبرمج حجم الحقن للسمكة الأولى عن طريق إدخال الحجم بالنانولتر باستخدام لوحة المفاتيح الرقمية في معالج micro four. وأخيرًا، قم بتحضير التخدير بالثلج عن طريق سحق كمية كافية من مكعبات الثلج المصنوعة من مياه مرافق تربية الأسماك.

لتعبئة وعاء الثلج، ضع طاولة الجراحة داخل حاوية أكبر، مثل حاوية تخزين طعام مصنوعة من المطاط بسعة 2.4 لتر. صب بعض مياه المنشأة الدافئة في الحاوية الخارجية وطاولة الجراحة. احتفظ بخزان احتياطي من مياه المنشأة الدافئة في مكان قريب.

ثبّت مقياس حرارة على الحاوية الخارجية. ضع الحاوية الخارجية للمخدر مع طاولة الجراحة بجوار المجهر. اجعل دلو رقائق الثلج قريباً منك.

ابدأ بإضافة قطع الثلج حتى تصل درجة حرارة الماء إلى 17 °C. يجب ألا تقل درجة الحرارة عن 17 °C في هذه الخطوة. استخدم شبكة لنقل الأسماك إلى الحاوية الخارجية.

عند درجة حرارة 17 درجة أو أقل قليلاً، عادةً ما تمد السمكة زعانفها الصدرية أفقياً، وتلهث، وتظهر حركات أذنية سريعة. أضف رقائق الثلج ببطء إلى الوعاء لخفض درجة الحرارة إلى 12 degrees Celsius على مدار عدة دقائق. ومع انخفاض درجة الحرارة، ستسبح السمكة ببطء أكبر ثم تتوقف عن السباحة في النهاية.

في النهاية، سيتوقف لهاث السمكة وستتباطأ حركات الغطاء الخيشومي. تكون السمكة جاهزة للحقن عندما لا تبدي أي رد فعل عند مناولتها. وبمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة، اضغط على الإسفنجة لتشبعها.

أبقِ أصابعك في الماء البارد لفترة كافية حتى لا تؤدي إلى تسخين السمكة وإخراجها من حالة التخدير. وأثناء التعامل مع السمكة بأصابع باردة، انقلها برفق إلى تجويف الإسفنجة. ضع السمكة بحيث يكون البطن للأعلى والخياشيم في التجويف.

انقل طاولة الجراحة بسرعة إلى منصة المجهر. وبسرعة ودقة، قم بوضع الإبرة بحيث يتجه رأسها نحو الجهة الرأسية ويكون أقرب إلى الحزام الحوضي منه إلى فتحة الشرج. أدخل الإبرة في الخط الناصف بين الزعانف الحوضية.

يجب أن تكون قادراً على الشعور عندما تصل الإبرة إلى عمق جدار الجسم. عند إدخال الإبرة، يمكنك الشعور بانفذاق جدار الجسم. وعندما تدخل الإبرة التجويف البطني، قم بحقن الحجم المناسب باستخدام المعالج الدقيق.

استخدم دواسة القدم لحقن 1 µL لكل جرام من وزن جسم السمكة، وبعد الحقن، اسحب الإبرة وانقل السمكة على الفور إلى حوض الماء الدافئ للتعافي. بعد تحرير السمكة من الإسفنجة فوق مياه الحوض، افحص الإبرة تحت المجهر؛ فقد تلتصق بها إحدى القشور أحياناً، لذا يجب إزالتها قبل عملية الحقن التالية.

بعد مرور فترة زمنية مناسبة، باشر بإجراء المقايسة اللاحقة. وقد وجدنا أن الصيام لمدة 72 hour ضروري لخفض جلوكوز الدم إلى المستوى الأساسي قبل الحقن. في هذا الشكل، تظهر بيانات المجموعة الضابطة غير المحقونة باللون الأخضر قيم جلوكوز دم لا تختلف اختلافاً جوهرياً عن المجموعات الضابطة المحقونة بالمادة الحاملة والموضحة هنا باللون الأحمر.

ومع ذلك، يوضح الخط الأزرق قيم جلوكوز الدم للأسماك التي حُقنت بالجلوكوز، ويُظهر ارتفاع وانخفاض مستويات الجلوكوز في الدورة الدموية. وبمرور الوقت، كانت الحيوانات التي حُقنت بالجلوكوز والتي حُقنت بالمحلول الناقل تحت تأثير التخدير الجراحي أثناء عملية الحقن، بينما لم تكن الضوابط غير المحقونة تحت التخدير الجراحي. لقد قدمنا لكم للتو كيفية إجراء الحقن داخل الصفاق في أسماك الزيبرا البالغة.

ندرس في مختبرنا التغيرات في تركيز جلوكوز الدم عند نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن داخل الصفاق (IP) لمحلول الجلوكوز. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية التي عرضناها لكم للتو لحقن المحلول الذي تهتمون بدراسته. عند القيام بهذا الإجراء، تذكروا تخدير السمكة ببطء والتعامل معها برفق.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.