الكشف عن نشاط تنظيم سياليداز Neu1 في اتصال مثل تنشيط مستقبلات

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم تحفيز نشاط sase الخلوي استجابةً لارتباط الربيطة بمستقبلها النوعي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة الخلايا على شرائح زجاجية دائرية بقطر 12 مليمتر في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً لمدة 24 ساعة. وكخطوة ثانية، يتم وضع الخلايا الحية الملتصقة بالشريحة الزجاجية في تلامس مباشر مع خليط مُعد مسبقاً من ركيزة sase وربيطة المستقبل، مع أو بدون مثبطات نوعية، على شريحة مجهرية تالياً.

توضع شريحة المجهر فوراً تحت مجهر فلوري لتصور الصور الفلورية والتقاطها رقمياً. ومع مرور الوقت، يتم الحصول على نتائج تظهر تغيرات في نشاط new one sase على سطح الخلية المرتبط بالخلايا الحية المعالجة بالربيطة، وذلك بناءً على شدة الفلورة الزرقاء المحيطة بالخلايا تحت المجهر الفلوري فوق الموضعي (epi fluorescence microscopy).

تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التحليل الطيفي الضوئي في استهلاك كمية أقل من الكواشف. كما يمكنك ملاحظة والتقاط صور لنشاط sase في الخلايا الحية. ويمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم المناعة، مثل دراسة التفاعلات المحتملة والجديدة بين الليجاند والمستقبل، وكذلك دراسة تأثيرات مثبطات إنزيمات أو بروتينات محددة على تنشيط المستقبل.

سيقوم بتوضيح الإجراء كل من الدكتور Ray Amit والدكتور PT Gath، وهما طالبان سابقان في مرحلة الدكتوراه من مختبري، حيث يستخدمان هذا المقايسة في دراساتهما البحثية. قبل إحياء خلايا البلاعم المجمدة، قم بتحضير وسط الزرع باستخدام delcos المفلتر والمعقم، وهو وسط modified eagles medium مدعم بـ 10%fetal bovine serum، وخمسة micrograms per milliliter من المضاد الحيوي plasmin. بعد ذلك، أضف أربعة milliliters من وسط الزرع إلى دورق زراعة خلايا بحجم 25 square centimeter لكل أنبوبة من الخلايا المجمدة، ثم أخرج أنبوبة الخلايا المجمدة من المجمد عند درجة حرارة minus 80 °C وقم بإذابتها سريعاً عن طريق التدفئة اليدوية داخل غطاء احتواء المخاطر البيولوجية المعقم.

ستستغرق هذه العملية حوالي دقيقتين إلى ثلاث دقائق. وبمجرد إذابة الخلايا، استخدم ماصة معقمة سعة 1 mL لنقلها بسرعة إلى قارورة زراعة الخلايا التي تحتوي على الوسط المكيف. ضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 °C و 5% carbon dioxide باستخدام مجهر مقلوب.

افحص الخلايا يومياً للتأكد من نموها والتصاقها حتى تصل نسبة التلاقي إلى 75% إلى 90% قبل بضعة أيام من زراعة الخلايا في مقايسة SASE. قم بتحضير الشرائح الزجاجية الدائرية بقطر 12 مليمتر التي ستُزرع فيها الخلايا، وذلك داخل كابينة الاحتواء للمخاطر البيولوجية.

ضع الشرائح في طبق بتري زجاجي كبير وعقمها عن طريق غمرها في ethanol 100% لمدة ساعة واحدة. تخلص من الكحول واترك الشرائح الزجاجية المبللة معرضة لتدفق الهواء المصفى والمعقم في الكابينة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 24 ساعة أو حتى تجف وتصبح جاهزة للزراعة. أولاً، يتم تعقيم ملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ مسنن ومنحنٍ بطول أربع بوصات عن طريق التعقيم باللهب.

ثم استخدم الملقط لوضع شريحة زجاجية دائرية معقمة واحدة بعناية في كل بئر من أطباق البوليسترين المعالجة للزراعة النسيجية ذات القاع المسطح والمكونة من 24 بئراً. وباستخدام ماصة معقمة سعة خمسة ملليلتر، قم بإزالة وسط DMEM المشروط من القارورة التي تحتوي على الخلايا البلعمية الملتصقة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول tris buffered saline معقم بتركيز 1x وبدرجة pH 7.4 لإزالة أي وسط يحتوي على المصل.

بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول ملحي منظم بالفوسفات خالي من الفوسفات ومحتوٍ على الكالسيوم عند pH 7.4. ضع الخلايا في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق تقريباً أو حتى تبدأ الخلايا في الانفصال داخل القارورة. بمجرد انفصال الخلايا، أضف 3 mL من وسط DMEM المُكيَّف إلى الخلايا العالقة.

بعد ذلك، انقُل 0.5 milliliters من المعلق الذي يحتوي على ما يقرب من 0.5 million خلية إلى كل شريحة زجاجية دائرية بقطر 12 millimeter في طبق يحتوي على 24 بئرًا، ثم حضِّن طبق زراعة الأنسجة الذي يحتوي على الخلايا البلعمية عند درجة حرارة 37 °C في 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق بالشرائح الزجاجية الدائرية. سيتم إجراء مقايسة نشاط sase تحت ثلاثة ظروف مختلفة على ثلاث شرائح مجهرية منفصلة؛ حيث تُستخدم الشريحة الأولى كعينة سالبة.

تُعرَّض الخلايا الضابطة إلى وسط التثبيت، وركيزة النيورامينيداز الخاصة بـ ANA، والمحلول الملحي الموقى بـ tris، ولكن دون تعريضها لرابط المستقبل الشبيه بالتول LPS. وفي الشريحة الثانية، تُعرَّض الخلايا إلى وسط التثبيت، ورابط المستقبل الشبيه بالتول LPS، والمحلول الملحي الموقى بـ tris.

في الشريحة الثالثة، يتم تعريض الخلايا إلى وسط التثبيت من ANA، وLPS Tris، والمحلول الملحي المنظم، ومثبط النيورامينيداز Tamiflu. سنقوم بشرح إجراء المقايسة الثانية فقط، حيث تختلف المقايسات الثلاث فقط في خليط المركبات الموجودة على شريحة المجهر. ضع شريحة المجهر على طاولة المختبر وأضف المركبات التالية بالترتيب التسلسلي.

أضف ميكروليتر واحد من وسط التثبيت، يليه ميكروليتر واحد من الفورمالديهايد، ثم ميكرولترين من LPS، وأخيرًا، ثلاثة ميكرولتر من المحلول الملحي المنظم بالتريس، pH 7.4. بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من بئر واحدة من طبق الـ 24 بئرًا الذي يحتوي على الخلايا. الخطوة التالية هي الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء، حيث يجب عليك إزالة غطاء الشريحة الزجاجي الدائري من بئر طبق زراعة الأنسجة باستخدام ملقط قياس 4 بوصات دون كسره.

ارفع الشريحة الزجاجية الدائرية برفق إلى زاوية البئر، ثم قم بإزالتها بعناية ووضع الشريحة بحيث تكون الخلايا متجهة للأسفل في خليط المحلول. انقل شريحة المجهر فوراً إلى مجهر فلوري انعكاسي (epi fluorescent microscope) تم ضبطه على مرشح الأشعة فوق البنفسجية (UV filter) ومجهز بكاميرا رقمية لالتقاط الصور الفلورية. قم بضبط تركيز المجهر باستخدام تباين الطور (phase contrast) حتى تظهر الخلايا، ثم انتقل إلى الوضع الفلوري.

قم بالتقاط صور للخلايا باستخدام وضع الفلورسنت عند الدقيقة الأولى، والدقيقة الثانية، والدقيقة الثالثة. بالإضافة إلى ذلك، التقط صورة واحدة للخلايا باستخدام تمثيل تباين الطور. تظهر هنا نتائج تجربة مقايسة sase.

أولاً، وكعينة ضابطة سلبية، وُضعت خلايا حية ملتصقة بشريحة زجاجية في تلامس مباشر مع مزيج موضعي من وسط التثبيت وركيزة الفورميداز، حيث لو كان نشاط IP sase موجوداً، فسيتم تحلل الركيزة لإنتاج ethyl lum beone حر، والذي يتميز بانبعاث فلوري عند 450 nanometers بعد الإثارة عند 365 nanometers، وقد تم أخذ القياس بعد دقيقتين من إضافة الركيزة.

تُظهر هذه الصورة الفلورية عدم وجود نشاط لإنزيم sase حول الخلايا. أما الصورة التالية فتُظهر نتائج مقايسة SASE إيجابية، حيث وُضعت خلايا حية ملتصقة بشريحة زجاجية في تلامس مباشر مع خليط نقطي من وسائط التثبيت ورقاء substrate 4 ورابط TLR 4 وهو LPS. تم تحلل الركيزة بواسطة إنزيم sase لإنتاج ethyl lum beone حر، وتشير الصورة الفلورية التي التُقطت بعد دقيقتين من إضافة الركيزة و LPS إلى مستويات عالية من نشاط sase حول الخلايا.

ومع ذلك، عندما وُضعت خلايا حية في تلامس مباشر مع خليط بقعي من أوساط التثبيت المكونة من ركيزة نانوية لربيطة TLR 4 وهي LPS، بالإضافة إلى مثبط النيورامينيداز، Tamiflu، انخفض نشاط السياز (sase) بشكل كبير أو لم يعد يُكتشف اعتماداً على تركيز المثبط. وأخيراً، يوضح هذا الرسم البياني التركيز التثبيطي بنسبة 50% لـ Tamiflu وOseltamivir carboxylate والذي تم تحديده من خلال رسم العلاقة بين انخفاض نشاط السياز ولوغاريتم تركيز العامل، حيث تم قياس متوسط الفلورة المحيطة بالخلايا لكل مجموعة. باستخدام برنامج Image J، وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استزراع الخلايا على أغطية زجاجية دائرية في أطباق زراعة الأنسجة ذات 24 بئراً قبل 24 ساعة من بدء مقايسة السياز (Sade assay).

بالإضافة إلى ذلك، يجب تحضير جميع الكواشف المستخدمة في هذا المقايسة قبل البدء في تنفيذها.