إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفات متوافقة لتعديل وقياس الانقباض الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنشيط شريحة غطاء للسماح بتثبيت المصفوفة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في بلمرة هلام بولي أكريلاميد على شريحة الغطاء المنشطة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في زرع الخلايا على الهلام وتركها حتى تلتصق. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تصوير الهلام لتوليد البيانات التي سيتم تحليلها بواسطة بروتوكولات مجهر قوة الشد. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر قيام الخلايا بتسليط قوى شد على مصفوفتها من خلال مجهر قوة الشد.

مرحباً، أنا إيفون إيونس من مختبر مارغريت ELL في قسم الفيزياء ومعهد الديناميكيات الفيزيائية الحيوية بجامعة شيكاغو. وأنا ستيفن وينتر أيضاً من مختبر غارد. نود اليوم أن نعرض لكم إجراءً لصنع مصفوفات مرنة لقياس التقلص الخلوي.

نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة شبكات actin mycin الانقباضية. لذا، دعونا نبدأ. قبل تنشيط شرائح التغطية، تم وضع عدة شرائح تغطية قياس 22 × 40 ملم من النوع 1.5 مسبقاً.

اشطف باستخدام 70% ethanol في رف من الفولاذ المقاوم للصدأ بحيث تكون شرائح الغطاء متباعدة وغير متلامسة. قم بتحضير محلول 2% three or minor profile trimeth في isopropanol داخل طبق زجاجي مربع، وذلك أثناء العمل داخل خزانة استخلاص كيميائية. استخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة three or minoro profile.

نظرًا لتفاعل Trimeth oxy مع البلاستيك، اغمر شرائح التغطية بالكامل في هذا المحلول واتركها لمدة 10 دقائق مع التحريك باستخدام لوح تحريك داخل خزانة استخلاص الغازات. وبعد نقع شرائح التغطية، اغسلها عن طريق غمرها في ماء مقطر مزدوج. استبدل الماء أربع مرات بعد عملية التبديل الأخيرة.

اترك شرائح التغطية لتنقع لمدة 10 دقائق مع التحريك. ثم جففها في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C تقريباً لمدة 10 دقائق. وبمجرد جفافها، اتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

اغمر شرائح التغطية في محلول غلوتارالدهيد (Glutaraldehyde) بتركيز 1% في ماء مقطر مزدوج. يتم ذلك في طبق زجاجي مربع على لوحة تحريك لمدة 30 دقيقة. تأكد من استخدام طبق نظيف.

وإلا، قد يبدو المحلول عكراً بعد ذلك. اغسل شرائح التغطية عبر ثلاث عمليات استبدال بماء مقطر مزدوج لمدة 10 دقائق لكل عملية استبدال مع التحريك. بعد ذلك، غطِّ شرائح التغطية بورق ألومنيوم لتجنب الغبار واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد جفافها، تُخزن شرائح الغطاء في مكان جاف بعيداً عن الغبار لمدة تصل إلى شهرين. لتحضير هلام البولي أكريلاميد أو PAA، يتم أولاً تحضير المحاليل المخزونية من Acrylamide bis. يتم تحضير خليط Acrylamide من 40%acrylamide و 2%bis acrylamide وفقاً لما هو موصوف في بروتوكول RI.

يتم إزالة الغازات (DGAs) من محلول الأكريلاميد في غرفة مفرغة من الهواء لمدة 20 دقيقة. وهذا يقلل من كمية الأكسجين داخل الهلام، مما يمنع عملية البلمرة. وفي هذه الأثناء، يتم تحضير محلول كبريتات الأمونيوم بتركيز 10% أو محلول PS.

بعد ذلك، امسح شرائح زجاجية للمجهر مقاس بوصة واحدة في ثلاث بوصات باستخدام مناديل rain X لجعل سطح الشريحة الزجاجية كارهاً للماء. قم بإزالة أي غبار باستخدام منديل Kim wipe لضمان الحصول على سطح هلامي أملس. غطِّ الشريحة بورق ألومنيوم واتركها جانباً.

بعد ذلك، قم بإزالة محلول الأكريلاميد من غرفة التفريغ وأضف الخرزات الفلورية. ولبدء بلمرة الهلام، أضف 0.75 µL من TM E و 2.5 µL من 10%a PS. امزج المحلول لفترة وجيزة عن طريق السحب والضخ بالماصة. بعد ذلك، ضع من 10 إلى 12 µL من محلول الأكريلاميد على شريحة المجهر الكارهة للماء التي تم تحضيرها مسبقاً.

ضع غطاء شريحة مُنشطاً بمقاس 22 في 40 مليمتر فوق القطرة. يجب أن يغطي محلول الهلام غطاء الشريحة بالكامل. قم بتسوية أي فقاعات قد تظهر داخل المحلول.

اترك محلول الهلام ليتـبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبًا. وبمجرد حدوث البلمرة، سينفصل الهلام عن حافة غطاء الشريحة. باستخدام الطرف الدقيق لملقط، قم بإزالة غطاء الشريحة بعناية من سطح شريحة المجهر مع الهلام الملتصق به.

اغمر الهلام في طبق بتري يحتوي على ماء مقطر مزدوج للحفاظ على سطح هلامي رطب لربط البروتين المكون للمصفوفة خارج الخلية أو ECM بالهلام. أولاً، قم بتحضير أجزاء عمل بحجم 40 µL من sulfur san par عن طريق إذابة مسحوق SULF san par في dimethyl sulf oxide أو DMSO اللامائي. بعد ذلك، قم بإزالة الماء المقطر المزدوج من سطح الهلام باستخدام جهاز تدوير غطاء الشريحة لفترة وجيزة.

يجب الحرص على عدم تجفيف الهلام مباشرة قبل الاستخدام. قم بتخفيف حصص sulfur sampa DMSO في ماء مقطر مرتين، وقم بتغطية مركز سطح الهلام بنحو 200 µL. بعد ذلك، عرض سطح الهلام للأشعة فوق البنفسجية في فرن الربط التشابكي بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker oven).

بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، اغمر شرائح التغطية في بيكر يحتوي على ماء مقطر مزدوج حديث. قم بإزالة أي محلول من سطح الهلام باستخدام جهاز تدوير شرائح التغطية. ثم ضع العينة في وعاء بتري وأضف 50 µL من الفيبرونيكتين البارد فوق العينة.

اقلب شريحة الغطاء وضع الجانب الهلامي فوق الفيبرونيكتين. اترك شرائح الغطاء لتتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين أو في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. يتم ذلك بعد الحضن في غطاء تهوية معقم لزراعة الأنسجة.

ضع شرائح التغطية في أطباق زراعة أنسجة سعة ستة سنتيمتر تحتوي على PBS لتغطية شرائح التغطية. اغسل شرائح التغطية جيداً بعدة عمليات تبديل لـ PBS تحت ظروف معقمة بعد الغسيل. عقم شرائح التغطية عن طريق المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم تحضين الشرائح الغطائية في وسط زراعة الخلايا لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة قبل استزراع الخلايا. بعد ذلك، يتم وضع شريحة غطائية بمقاس 22 في 30 مليمتر على حامل الشريحة الغطائية العلوي في غرفة التصوير البؤري من شركة Warner Instruments، مع استخدام شحم الفراغ لتثبيت الشريحة الغطائية في مكانها. ضع حشية مطاطية لتشكيل الغرفة فوق الشريحة الغطائية، مع السماح بالوصول إلى أنابيب البولي إيثيلين الخاصة بالمدخل والمخرج.

سيسمح ذلك بوجود مسافة تتراوح من 150 إلى 1000 ميكرون بين غطاء الشريحة العلوي وغطاء الشريحة المكسو بالجل بمقاس 22 by 40 مليمتر، وذلك اعتماداً على حجم الحشية المستخدمة. بعد ذلك، قم بتعبئة المحاقن التي تحتوي على وسط خلوي دافئ في أنابيب الإدخال عبر مجموعة الموصلات، وتحقق من تدفق الوسط عبر الأنابيب وصولاً إلى غطاء الشريحة العلوي. ضع الشحم المفرغ على قاعدة الغرفة، ثم ضع غطاء شريحة مكسو بالجل بمقاس 22 by 40 مليمتر بحيث يكون جانب الخلية متجهاً للأعلى.

قم بإضافة الوسط الدافئ إلى الخلايا. ضع حامل الشريحة الغطائية العلوية فوق قاعدة الحجرة، بحيث تفصل حشوات الحجرة بين الحامل والشريحة الغطائية المطلية بالهلام. تأكد من استقرار دبابيس التحديد الموجودة داخل قاعدة الحجرة في ثقوب التحديد الموجودة في الشريحة الغطائية العلوية.

ضع لوحة الضغط على قاعدة الغرفة، واستخدم مفتاح ربط لوحة الضغط لربط لوحة الضغط وتثبيتها. تحقق من تدفق الوسط عبر الأنابيب والغرفة لمراقبة أي تسربات محتملة داخل الغرفة، وللقضاء على أي مناطق خالية من الوسط على سطح الخلايا.

قم بتثبيت غرفة التصوير البؤري على محول المنصة الموجود داخل حامل المجهر لتصوير البروتين المسمى فلوريسنتياً والخرز الفلوريسنتي المدمج داخل ركيزة الهلام باستخدام مجهر فلوريسنتي بؤري، وذلك للحصول على صورة لموضع الخرز غير المجهد داخل تدفق الهلام. قم بإجراء عمليات النبض لفصل الالتصاقات الخلوية عن الهلام والتقاط صورة للخرز الفلوريسنتي في نفس مجال التصوير الذي تتوفر فيه الخلايا. عند اتباع البروتوكول بشكل صحيح، سيكون سطح الهلام مسطحاً وناعماً نسبياً مع توزيع الخرز الفلوريسنتي بشكل متساوٍ في جميع أنحائه.

يمكن أيضاً تصور المصفوفة خارج الخلية (ECM) عن طريق التألق المناعي للفبرونكتين. وإذا كان القياس يتم لانكماش الهلام في موقع الالتصاقات البؤرية، فيجب إجراء تصوير للهلام والخلايا عند المستوى البصري المجهري لـ confocal الخاص بالالتصاقات البؤرية. هنا، يتم تصور الالتصاقات البؤرية في تجربة قوة الجذب في خلايا الساركوما العظمية البشرية أو خلايا U2 OS المعلمة بـ GFP pxi.

يمكن تصور انكماش الهلام من خلال إزاحة الخرزات الفلورية المدمجة تحت الالتصاقات البؤرية. وتسمح مقارنة مواقع الخرزات المشدودة باللون الأخضر ومواقع الخرزات غير المشدودة باللون الأحمر بقياس إزاحة الركيزة الهلامية تحت تأثير الانكماش؛ تظهر هنا نتيجة ممثلة لخلية منبسطة تنفصل عن سطح الهلام بواسطة التريبسين. وهنا تظهر نتيجة ممثلة عند مقارنة مواقع الخرزات المشدودة وغير المشدودة.

يمكن أن يؤدي استخدام خوارزميات حاسوبية متطورة إلى استخراج إجهادات السحب المرتبطة بإزاحة الحبيبات ومعامل المرونة للهلامات. وتظهر هذه الإجهادات هنا من خلال خريطة تدرج لوني ومتجهات، حيث تشير الألوان الأكثر دفئاً على الخريطة الحرارية والأسهم الأكبر إلى قوى أقوى. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إعداد مصفوفات مطاوعة لقياس الانكماش الخلوي عند تنفيذ هذا الإجراء.

من المهم التخطيط المسبق حتى يمكن تنفيذ الخطوات الحساسة للوقت بسرعة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.