إعداد مصفوفات شكوى لقياس تقلص الخليوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مصفوفات ممتثلة لتعديل وقياس التقلص الخلوي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنشيط شريحة غطاء للسماح بتثبيت المصفوفة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في بلمرة هلام بولي أكريلاميد على شريحة الغطاء المنشطة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في زرع الخلايا على الهلام وتركها لتلتصق. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تصوير الهلام لتوليد بيانات يتم تحليلها بواسطة بروتوكولات مجهر قوة السحب. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تطبيق الخلايا لقوى سحب على مصفوفتها من خلال مجهر قوة السحب.

مرحباً، أنا إيفون إيونس من مختبر مارجريت ELL في قسم الفيزياء ومعهد الديناميكيات الفيزيائية الحيوية بجامعة شيكاغو. وأنا ستيفن وينتر أيضاً من مختبر غارد. نود اليوم أن نعرض لكم إجراءً لتحضير مصفوفات مرنة لقياس الانكماش الخلوي.

نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة شبكات الأكتين والميوسين الانقباضية. لذا، دعونا نبدأ. قبل تنشيط شرائح التغطية، تم وضع عدة شرائح تغطية مقاس 22 × 40 مليمتر من النوع 1.5 مسبقاً.

اشطف باستخدام 70% ethanol في رف من الفولاذ المقاوم للصدأ بحيث تكون شرائح التغطية متباعدة ولا تتلامس. وأثناء العمل داخل خزانة استخلاص كيميائية، قم بتحضير محلول 2% three or minor profile trimeth في isopropanol داخل طبق زجاجي مربع. استخدم ماصة باستور زجاجية لإضافة three or minoro profile.

بسبب تفاعله مع البلاستيك، اغمر شرائح التغطية تماماً في محلول Trimeth oxy واتركها لمدة 10 دقائق مع التقليب باستخدام لوح تحريك داخل خزانة استرداد الغازات. بعد نقع شرائح التغطية، اغسلها عن طريق غمرها في ماء مقطر مزدوج. قم بتغيير الماء أربع مرات بعد التغيير النهائي.

اترك شرائح التغطية لتُنقع لمدة 10 دقائق مع التقليب. ثم جفف شرائح التغطية في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تقريباً لمدة 10 دقائق. وبمجرد جفافها، اتركها لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

اغمر شرائح التغطية في محلول Glutaraldehyde بتركيز 1% في ماء مقطر مزدوج. ضعها في طبق زجاجي مربع على جهاز تحريك مغناطيسي لمدة 30 دقيقة. تأكد من استخدام طبق نظيف.

وإلا، فقد يظهر المحلول عكراً بعد ذلك. اغسل شرائح التغطية من خلال ثلاث عمليات استبدال بالماء المقطر مرتين لمدة 10 دقائق لكل عملية استبدال مع التحريك. بعد ذلك، غطِّ شرائح التغطية بورق ألومنيوم لتجنب الغبار واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد جفافها، تُحفظ شرائح التغطية في مكان جاف بعيداً عن الغبار لمدة تصل إلى شهرين. لتحضير هلام البولي أكريلاميد أو PAA gel، قم أولاً بتحضير محاليل مركزة من Acrylamide bis. يتم تحضير Acrylamide Mix من 40%acrylamide و 2%bis acrylamide كما هو موضح في بروتوكول RI.

قم بإزالة الغازات من محلول الأكريلاميد في غرفة تفريغ لمدة 20 دقيقة. هذا يقلل من مستوى الأكسجين داخل الهلام، مما يمنع البلمرة. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول كبريتات الأمونيوم بتركيز 10% أو محلول APS.

بعد ذلك، امسح شرائح زجاجية مجهرية بمقاس بوصة واحدة في ثلاث بوصات باستخدام مناديل rain X لجعل سطح الشريحة الزجاجية كارهاً للماء. قم بإزالة أي غبار باستخدام منديل Kim لضمان الحصول على سطح هلامي أملس. غطِّ الشريحة بورق ألومنيوم واتركها جانباً.

بعد ذلك، قم بإزالة محلول الأكريلاميد من غرفة التفريغ وأضف الخرزات الفلورية. لبدء بلمرة الهلام، أضف 0.75 µL من TM E و 2.5 µL من 10%a PS. اخلط المحلول لفترة وجيزة عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة. بعد ذلك، ضع من 10 إلى 12 µL من محلول الأكريلاميد على شريحة المجهر الكارهة للماء التي تم تحضيرها مسبقاً.

ضع شريحة غطاء منشطة بمقاس 22 × 40 ملم فوق القطرة. يجب أن يغطي محلول الهلام الشريحة بالكامل. قم بتسوية أي فقاعات قد تظهر داخل المحلول.

اترك محلول الهلام ليتلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريباً. وبمجرد تلمره، سينفصل الهلام عن حافة غطاء الشريحة. باستخدام الطرف الدقيق لملقط، قم بإزالة غطاء الشريحة بحذر من سطح شريحة المجهر مع الهلام الملتصق به.

اغمر الهلام في طبق بتري يحتوي على ماء مقطر مزدوج للحفاظ على رطوبة سطح الهلام من أجل ربط بروتين المصفوفة خارج الخلوية أو ECM بالهلام. أولاً، قم بتحضير حصص عمل بحجم 40 µL من sulfur san par عن طريق إذابة مسحوق SULF san par في dimethyl sulf oxide أو DMSO اللامائي. بعد ذلك، قم بإزالة الماء المقطر المزدوج من سطح الهلام باستخدام جهاز تدوير غطاء الشريحة لفترة وجيزة.

يجب الحرص على عدم تجفيف الهلام مباشرة قبل الاستخدام. يتم تخفيف حصص sampa sulfur في DMSO باستخدام ماء مقطر مزدوج، ثم يتم طلاء مركز سطح الهلام بنحو 200 microliters. بعد ذلك، يتم تعريض سطح الهلام للأشعة فوق البنفسجية في فرن ربط تشابكي بالأشعة فوق البنفسجية (UV crosslinker oven).

بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية، اغمر شرائح التغطية في دورق يحتوي على ماء مقطر مزدوج جديد. قم بإزالة أي محلول من سطح الهلام باستخدام جهاز تدوير شرائح التغطية. بعد ذلك، ضع العينة في طبق بتري، ثم أضف 50 µL من الفيبرونيكتين البارد فوق العينة.

اقلب غطاء الشريحة وضع الجانب الهلامي فوق الفايبرونيكتين. اترك أغطية الشرائح لتتفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين ساعة وساعتين أو في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. يتم ذلك بعد الحضانة داخل غطاء تهوية معقم لمزارع الأنسجة.

ضع شرائح الغطاء في أطباق زراعة أنسجة سعة ستة سنتيمتر تحتوي على PBS لتغطية شرائح الغطاء. اغسل شرائح الغطاء جيداً بعدة عمليات استبدال لـ PBS تحت ظروف معقمة بعد الغسيل. قم بتعقيم شرائح الغطاء عن طريق المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية UV لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم تحضين شرائح التغطية في وسط زراعة الخلايا لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة قبل زراعة الخلايا. بعد ذلك، يتم وضع شريحة تغطية مقاس 22 × 30 مليمتر على حامل شريحة التغطية العلوي في غرفة التصوير confocal الخاصة بشركة Warner Instruments باستخدام شحم تفريغ (vacuum grease) لتثبيت شريحة التغطية في مكانها. ثم توضع حشية مطاطية لتشكيل الغرفة فوق شريحة التغطية، مع السماح بالوصول إلى كل من أنابيب البولي إيثيلين الخاصة بالمدخل والمخرج.

سيسمح ذلك بترك مسافة تتراوح من 150 إلى 1000 ميكرون بين غطاء الشريحة العلوي وغطاء الشريحة المطلي بالهلام مقاس 22 في 40 مليمتر، وذلك اعتماداً على حجم الحشية المستخدمة. بعد ذلك، قم بتعبئة المحاقن التي تحتوي على وسط خلوي دافئ في أنابيب الإدخال عبر مجموعة الموصلات، وتحقق من تدفق الوسط عبر الأنابيب وصولاً إلى غطاء الشريحة العلوي. ضع شحم الفراغ على قاعدة الحجرة، ثم ضع غطاء شريحة مطلي بالهلام مقاس 22 في 40 مليمتر بحيث يكون جانب الخلية متجهاً للأعلى.

أضف الوسط الدافئ إلى الخلايا. ضع حامل الشريحة الغطائية العلوية فوق قاعدة الحجرة بحيث تفصل حشوات الحجرة بينهما وبين الشريحة الغطائية المطلية بالهلام. تأكد من استقرار دبابيس التحديد الموجودة داخل قاعدة الحجرة في ثقوب التحديد الموجودة في الشريحة الغطائية العلوية.

ضع لوحة الضغط على قاعدة الغرفة واستخدم مفتاح ربط لوحة الضغط لربط لوحة الضغط وتثبيتها. تحقق من تدفق الوسط عبر الأنابيب والغرفة لمراقبة أي تسريبات محتملة داخل الغرفة، وللقضاء على أي مناطق خالية من الوسط على سطح الخلايا.

قم بتركيب غرفة التصوير البؤري على محول المنصة الموجود داخل حامل المجهر لتصوير البروتين المسمى فلوريسنتياً والخرز الفلوريسنت المدمج داخل ركيزة الهلام باستخدام مجهر فلوريسنت بؤري، وذلك للحصول على صورة لموضع الخرز غير المجهد داخل تدفق الهلام. قم بإجراء عمليات النبض لفصل الالتصاقات الخلوية عن الهلال والتقاط صورة للخرز الفلوريسنت في نفس مجال التصوير الذي تظهر فيه الخلايا. عند اتباع البروتوكول بشكل صحيح، سيكون سطح الهلام مسطحاً وناعماً نسبياً مع توزيع الخرز الفلوريسنت بشكل متساوٍ في جميع أنحائه.

يمكن أيضاً تصور المصفوفة خارج الخلية (ECM) عن طريق التألق المناعي للفيبرونكتين. وفي حال قياس انكماش الهلام في موقع الالتصاقات البؤرية، يجب إجراء تصوير للهلام والخلايا عند المستوى البصري البؤري للالتصاقات البؤرية. هنا، يتم تصور الالتصاقات البؤرية في تجربة قوة الجذب في خلية ساركوما عظمية بشرية أو خلية U2 OS معلمة بـ GFP pxi.

يمكن تصور انكماش الهلام من خلال إزاحة الخرزات الفلورية المدمجة تحت الالتصاقات البؤرية. تتيح مقارنة مواضع الخرزات المتعرضة للإجهاد باللون الأخضر ومواضع الخرزات غير المتعرضة للإجهاد باللون الأحمر قياس إزاحة الركيزة الهلامية تحت تأثير الانكماش؛ فيما يلي نتيجة نموذجية لخلية منبسطة انفصلت عن سطح الهلام بواسطة التريبسين. وهنا نتيجة نموذجية عند مقارنة مواضع الخرزات المتعرضة للإجهاد وغير المتعرضة له.

يمكن أن يؤدي استخدام خوارزميات حاسوبية متطورة إلى استنتاج إجهادات السحب المرتبطة بإزاحة الخرزات ومعامل المرونة للهلامات. يتم تصور هذه الإجهادات هنا باستخدام خريطة مقياس حراري ومتجهات، حيث تشير الألوان الأكثر دفئاً في الخريطة الحرارية والأسهم الأكبر إلى قوى أقوى. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير مصفوفات مرنة لقياس التقلص الخلوي عند تنفيذ هذا الإجراء.

من المهم التخطيط مسبقاً حتى يمكن تنفيذ الخطوات الحساسة للوقت بسرعة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.