$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
خذ مزرعة بكتيريا Pseudomonas aeruginosa في المرق.
ضع المزرعة على أجار العزل واحتضان لتعزيز نمو البكتيريا وإنتاج الجينات ، وهو عديد السكاريد الخارجي المكون من أحماض اليورونيك.
أضف محلول ملحي متساوي التوتر إلى العشب البكتيري وكشط لجمع الخلايا البكتيرية مع الجينات.
انقل المعلق إلى أنبوب ، دوامة لتفريق المحتويات ، وضعه على الجليد لمنع التدهور الأنزيمي.
قم بقياس الكثافة الضوئية ، أو OD ، لتحديد كثافة البكتيريا.
أضف المعلق البكتيري إلى محلول البورات الحمضي واخلطه لتحلل الجينات في مونومرات حمض اليورونيك.
أضف الكاربازول ، وهو كاشف كروموجيني ، واحتضن. في ظل الظروف الحمضية ، يتفاعل الكاشف مع أحماض اليورانيك لتشكيل مجمعات ملونة.
قم بقياس الامتصاص لقياس مستويات حمض اليورونيك ، والتي تعكس تركيز الألجينات.
باستخدام منحنى قياسي ، حدد تركيز الألجينات ، ثم قسمه على كثافة الخلايا البكتيرية المقاسة لحساب إنتاج الألجينات لكل وحدة من الكتلة الحيوية.
لبدء اختبار حمض اليورونيك كاربازول ، حدد مستعمرة واحدة من ثقافة نقية من السلالة المطلوبة ليتم اختبارها واختر المستعمرة باستخدام عود أسنان معقم.
ضع عود الأسنان في أنبوب اختبار مزرعة يحتوي على خمسة ملليلتر من PIB. تنمو في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، أضف كمية من مرق PIB المستزرع على طبق PIA دافئ مسبقا.
باستخدام موزع خلايا معقم ، انشر المرق على الطبق وينمو عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. باستخدام وحدة تحكم في الماصة وماصة معقمة سعة 50 ملليلتر ، أضف 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى العشب البالغ واجمع العينة عن طريق كشط اللوحة باستخدام موزع الخلية. استنشق العينة باستخدام ماصة جديدة سعة 50 ملليلتر وانقلها إلى أنبوب تجميع سعة 50 مل.
دوامة العينة على ارتفاع لخلط العينات ووضعها على الثلج. لقياس OD 600 من العينات، قم أولا بإفراغ مقياس الطيف الضوئي باستخدام مليلتر واحد من كلوريد الصوديوم 0.85٪. ثم أضف مليلترا واحدا من العينة إلى كوفيت جديد يمكن التخلص منه واقرأ OD. كرر هذه الخطوة مرتين للحصول على ثلاث نسخ من القراءات لكل عينة.
أضف الآن ثلاثة ملليلتر من محلول بورات حامض الكبريتيك إلى أنابيب الاستزراع واتركه على الثلج. أضف 350 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها ببطء إلى الخليط الحمضي في أنابيب الاختبار. بعد الدوامة لفترة وجيزة على مستوى منخفض ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الكاربازول والإيثانول بنسبة 0.1٪ إلى خليط العينة الحمضية.
قم بتغطية الأنبوب والدوامة على الإعداد المتوسط لمدة خمس ثوان. ثم ضعها في حمام جاف على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة على ارتفاع واتركها لتبرد لمدة خمس دقائق.
استخدم الأنبوب الذي يحتوي على 0.85٪ كلوريد الصوديوم كفارغ لمقياس الطيف الضوئي. ثم أضف مليلترا واحدا من الخليط إلى كوفيت نظيف واقرأ OD للعينات عند 530 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي. قم بإعداد منحنى قياسي عن طريق قياس OD 530 من التخفيفات التسلسلية للتركيزات المعروفة لحمض d-manuronic.
كرر مرتين واستخرج معادلة خطية من هذه القراءات. احسب تركيز الجينات في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي واقسم تركيز الجينات من المعادلة الخطية على OD 600 للحصول على الكمية الإجمالية للجينات لكل OD 600.