التنظيف الانتقائي لديدان التهاب القيعان الهندي لتثبيط ميكروبيوم الأمعاء

خذ طبق زراعة يحتوي على يرقات التهاب القائنات التي تحتضن البكتيريا محل الاهتمام التي تستعمر تلوين أمعاءها.

تحتوي الطبق على سلالة بكتيرية معروفة كطعام. تجويع الديدان حتى تستهلك كل البكتيريا وتدخل مرحلة السبات.

أضف وسطا وانقل الديدان إلى أنبوب.

قم بالطرد المركزي وتخلص من السوبرناتانت.

أضف محلول منظف، حرك لإزالة البكتيريا الملتصقة بالسطح، استخدم الطرد المركزي مرة أخرى، وتخلص من السوبرناتانت.

كرر الغسيل، ثم انقل الديدان إلى طبق زراعة جديد.

دع الزحف يزيل البكتيريا الغذائية المتشابكة بشكل غير محكم من سطح الأمعاء وفتحة الأمعاء مع الاحتفاظ بالبكتيريا التي تستعمر الأمعاء بشكل ثابت.

كرر خطوة النقل والزحف لضمان إزالة البكتيريا الغذائية بالكامل.

أضف الوسط، وانقل الديدان إلى زجاج ساعة، ثم تشريح لكشف أمعائها.

قم بتشريح الأمعاء التي تحتوي على البكتيريا المعنية، واجمعها في أنابيب مملوءة بالماء، ثم جمدها لاستخدامها لاحقا.

لتجويع الديدان وتقليل عدد بكتيريا OP50-1، حضن الديدان الخيطية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. أضف 5 ملليتر من وسط M9 إلى صفيحة الديدان التي فقدت جوعا مؤخرا، ثم انقل وسط M9 والديدان إلى أنبوب طرد مركزي معقم بقطر 15 ملم ليدور بسرعة 1000 مرة في الغرام لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة المادة الفائقة قبل غسل الديدان خمس مرات باستخدام 10 ملليلتر من M9 يحتوي على 0.05٪ ترايتون X-100 على جهاز نوتاتور لمدة 20 دقيقة. بعد آخر غسل، أزل المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبات في محلول 100 ميكرولتر وانقل M9 والديدان إلى صفيحة NGM غير مزروعة بطول 6 سنتيمترات. اترك الصفيحة تجف بينما تزحف الديدان لمدة 20 دقيقة للمساعدة في إزالة OP50-1 من الجلد والأمعاء.

عندما تجف اللوحة، كرر العملية بإضافة 250 ميكرولتر من M9 ونقل الديدان إلى صفيحة NGM جديدة غير مزروعة بطول 6 سنتيمترات للسماح للديدان بالزحف أثناء جفاف اللوحة.

بعد 20 دقيقة، أضف 250 ميكرولتر من M9 إلى اللوحة وانقل 100 ميكرولتر من M9 مع الديدان إلى زجاج ساعة نظيف.

ثم قطع رأس الديدان الخيطية باستخدام إبرة حقنة عيار 26 مع تثبيت الدودة بإبرة حقنة أخرى عيار 26.

بمجرد قطع الرأس، ستبتعد الأمعاء والكتلة الحبيبية والغدد التناسلية الشفافة بشكل طبيعي عن جسم الدودة، ثم تقطع قطعة من الأمعاء المكشوفة وتنقل أمعاء واحدة مقطعة إلى أنبوب PCR سعة 0.5 ملليلتر يحتوي على 10 ميكرولتر من الماء المعقم. كرر الإجراء لجمع الأمعاء من خمسة مختلفة على الأقل في أنابيب PCR.

جمد أنابيب PCR عند ناقص 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 5 دقائق. قم بإذابة عينات الأمعاء قبل المضي قدما في PCR والتسلسل للتحديد.