قياس الحث التلقائي للعواقم في البكتيريا الحالة في بكتيريا ليزوجينية بمرور الوقت

خذ مزرعة ليلية لبكتيريا ليزوجينية (lysogenic)، حيث تحمل معظم الخلايا حمض DNA لـ phage خامل مدمج داخل جينومها.

قم بتلقيحه في أوساط جديدة ثم حضّنه.

تخضع بعض البكتيريا لتحفيز تلقائي، حيث تدخل في الدورة الحالة، التي يتم فيها استئصال DNA العاثية وتضاعفه، وإنتاج البروتينات الفيروسية.

تتحرر العاثيات المعدية المجمعة حديثاً من خلال تحلل الخلايا.

اجمع عينات من المزرعة في فترات زمنية محددة.

لعدّ الخلايا الليزوجينية الحيوية غير المستحثة، يتم وضع تخفيفات متسلسلة من كل عينة على طبق آغار ثم تحضينها.

قم بعد المستعمرات لحساب الوحدات المكونة للمستعمرات (CFUs).

لعد العاثيات المعدية، يتم وضع نفس التخفيفات على طبق أغار يحتوي على مضاد حيوي ومزروع مسبقاً بخلايا عائل مؤشرة مقاومة للمضاد الحيوي. وبما أن الخلايا المدمجة (lysogens) حساسة للمضاد الحيوي، فإن العوائل المقاومة فقط هي التي يمكنها النمو.

تُصيب العاثيات الخلايا وتُحللها، مكونةً لويحات شفافة.

قم بعدّ اللويحات لحساب وحدات تشكيل اللويحات (PFUs). تشير قيم PFUs المنخفضة إلى عدد أقل من أحداث الحث التلقائي.

قم برسم مخطط بياني لـ CFUs و PFUs بمرور الوقت. خلال المرحلة الأسية المبكرة من النمو البكتيري، تكون PFUs في أدنى مستوياتها بالنسبة لـ CFUs، مما يشير إلى الحد الأدنى من الحث التلقائي للعواقم.

للبدء، قم بإعداد مستنبتات حديثة من الليسوجين والمضيف المؤشر عن طريق تلقيح المستنبتات الليلية في 100 milliliters من LB بنسبة 1:100. ثم تُحضن عند 37 degrees Celsius مع الرج بسرعة 180 RPM.

لمراقبة نمو الليسوجين، يتم جمع عينة بحجم 1 mL كل ساعة بدءاً من لحظة التلقيح ولمدة ثماني ساعات. يتم تخفيف المزرعة تسلسلياً بإضافة 100 µL إلى 900 µL من وسط LB. يتم الرج باستخدام جهاز الفورتكس بأقصى سرعة، ومواصلة سلسلة التخفيف من 10⁻¹ إلى 10⁻⁹.

قم بتنقيط 10 µL من التخفيف المطلوب على طبق آغار LB. اترك العينات لتجف ثم حضنها عند 30 °C لمدة تتراوح بين 18 إلى 24 ساعة. بعد التحضين، قم بعدد المستعمرات واحسب عدد الخلايا البكتيرية الحية باستخدام الصيغة المعطاة.

بعد ذلك، ولتعداد جزيئات الفاج المعدية في العينة الزمنية، أضف 100 ميكرولتر من خلايا المضيف المؤشرة المقاومة للريفامبيسين في طور النمو اللوغاريتمي إلى الآجار العلوي المصهور، جنباً إلى جنب مع الريفامبيسين. ضع 10 ميكرولتر من مزرعة الليسوجين المخففة تسلسلياً على طبقة الآجار العلوي الملقحة. اتركها لتجف، ثم حضنها عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة.

بعد الحضن، قم بعدد اللويحات وحساب جسيمات العاثية المعدية باستخدام الصيغة المعطاة.