الداخلي للهندسة الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أنسجة رئوية مستنبتة تكون مماثلة من الناحيتين المورفولوجية والفسيولوجية لأنسجة الرئة الطبيعية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال استئصال القلب والرئتين من جرذ بالغ. وتتمثل الخطوة التالية في إجراء عملية كانيولية للشريان الرئوي والرغامى، وتوصيل الرئتين اللتين خضعتا للكانيولية بمفاعل حيوي لغرض إزالة الخلايا.

بعد إزالة الخلايا والشطف، يتم نقل الرئة إلى مفاعل حيوي معقم للاستنبات وتجهيزها لعملية الزرع. تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في زرع الخلايا في الحجرة المطلوبة من الرئة باستخدام مجموعة خلوية مُحضرة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر إعادة استيطان المصفوفة خارج الخلوية منزوعة الخلايا بكفاءة بواسطة خلايا تُعبر عن علامات رئوية محددة إقليمياً من خلال مجهر التألق المناعي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لاستزراع خلايا الرئة في المختبر في أن الخلايا تحافظ على أنماطها الظاهرية المتمايزة لفترة زمنية ممتدة، مما يتيح دراستها لعدة أسابيع في ركيزة مشتقة بيولوجياً ثلاثية الأبعاد. ولإجراء عملية إزالة الخلايا، يتم توصيل الرئتين بغطاء المفاعل الحيوي عبر القنية الوعائية، ويتم توصيل الغطاء بجهاز إزالة الخلايا. ويتم تثبيت الزجاجة الموجودة فوق الرئتين في مكانها بواسطة حامل حلقي ومشبك مثبت.

في هذه المرحلة، يمكن إزالة المواد الخلوية لإنتاج سِقالة من المصفوفة خارج الخلية، والتي يمكن إعادة استزراعها بالمواد الخلوية. يوضح هذا المخطط تجميع المفاعل الحيوي من أجل استزراع وزرع أنسجة الرئة المهندسة. يتصل موصل اللور لوك (lure lock) الخاص بالقنية الرغامية بحلقة تنفس بين خزان الرغامي والغرفة الرئيسية.

تتضمن حلقة التنفس صمامين أحاديي الاتجاه، وموضعة بحيث يتبع الوسط مساراً مختلفاً عند الدخول إلى الرئة والخروج منها. كما يتم دمج خزان صغير مؤقتاً في خط التروية لغرض استزراع الخلايا البطانية.

تُستخدم مضخة نابضة لنقل الخلايا من الخزان إلى الحيز الوعائي للرئة. ويتم توفير التروية الوعائية باستخدام مضخة أسطوانية. حيث يتم ضخ الوسط في الشريان الرئوي عبر القنية المتصلة، ليتدفق عبر الأوعية الدموية الرئوية ويخرج من الوريد الرئوي مباشرة إلى المفاعل الحيوي الرئيسي حيث يتم سحب الوسط لإعادة التروية.

يتم وضع الظهارة الرئوية عن طريق الحقن في حلقة التنفس. وتُستخدم الغرفة الرئيسية التي تحتوي على الرئة وخزان الرغامي لزراعة الرئة على المدى الطويل. وعندما يتم استخراج الرئتين وتمرير القنيات في الشريان والرغامي بشكل صحيح، يجب أن تحتفظ الرئتان المستخرجتان حديثاً بالهواء دون تسريب.

يمكن التحقق من ذلك عن طريق نفخها بالهواء أثناء غمرها في السائل، حيث يجب ألا تظهر أي فقاعات تشير إلى وجود تسرب للهواء. لبدء البروتوكول، يتم نفخ الرئتين بـ PBS يحتوي على sodium nitropress side حتى تمتلئ الرئتان دون إفراط في النفخ، ثم يتم سد كانيولا الرغامي فوراً لتبقى الرئتان منتفختين.

بعد ذلك، يتم تروية الرئتين بمحلول PBS وSNP لمدة 15 دقيقة على الأقل بضغط 15 millimeters of mercury. بعد ذلك، أزل السدادة من القنية الرغامية للسماح للرئتين بالتفريغ من الهواء. استمر في التروية بمحلول PBS وSNP لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة إذا لزم الأمر.

أعد ملء PBS وSNP لضمان الحفاظ على ضغط التروية عند 10 إلى 15 millimeters of mercury. لبدء إجراء إزالة الخلايا لفترة طويلة، يتم توصيل غطاء المفاعل الحيوي بجهاز إزالة الخلايا. بعد ذلك، يتم توصيل الرئتين بالغطاء.

باستخدام وصلات القفل اللولبية (lure lock) المرتبطة بالقنية التي تأخذ شكل حرف Y، يجب توصيل قنية الشريان الرئوي بخط التروية، بينما تترك القنية الرغامية طافية بحرية. ولضمان إزالة الخلايا بالكامل من النسيج، من الضروري منع دخول الهواء إلى النظام. وتساعد الصمامات أحادية الاتجاه الموجودة في القنيتين الشريانية والرغامية على التخلص من فقاعات الهواء في الأنابيب عن طريق السماح بتدفق عكسي داخلها.

وبناءً على ذلك، يُسمح بإزالة فقاعات الهواء بواسطة المحقنة، مع التأكد من خلو جميع الخطوط من الهواء. ابدأ عملية التروية باستخدام محلول إزالة الخلايا. يتم التروية بمحلول إزالة الخلايا.

حتى يتم تروية 500 milliliters من المحلول عبر الرئتين، يكون الضغط الأمثل أقل من 15 millimeters of mercury. سيتطلب هذا عادةً 2.5 hours. تكون معدلات التدفق بطيئة جدًا في البداية عادةً، ثم تزداد بسرعة خلال الساعة الثانية لتصل إلى حوالي one milliliter per minute أو أكثر.

أثناء عملية التروية، قم بإزالة سائل إزالة الخلايا المستخدم من المفاعل الحيوي بشكل دوري، مع التأكد من بقاء كمية كافية من السائل لدعم الرئة وكانولا الرغامي. عند اكتمال التروية بسائل إزالة الخلايا، انقل الرئتين والمفاعل الحيوي إلى غطاء استنبات الأنسجة. لبدء شطف العضو، قم بإزالة الوعاء سعة 500 milliliter الذي يحتوي على سائل إزالة الخلايا واستبدله بوعاء معقم يحتوي على ما يصل إلى لتر واحد من PBS المعقم.

استخدم الشفط بالتفريغ أو حقنة لضمان خلو الخطوط من الهواء، ثم قم بتروية PBS عبر الأوعية الدموية بضغط يتراوح من 10 إلى 15 millimeters of mercury بنفس الطريقة. وكما هو الحال في عملية إزالة الخلايا، قم بإزالة PBS المستهلك من المفاعل الحيوي بشكل دوري باستخدام تقنيات معقمة، ثم استبدل أو أعد ملء وعاء PBS. استمر في الشطف باستخدام PBS معقم وجديد حتى يتم تروية الرئتين بـ 2.5 liters على الأقل من PBS المعقم.

تستغرق هذه العملية عادةً يومين من بداية عملية إزالة الخلايا وحتى اكتمال الشطف. انقل الرئتين إلى نظام مفاعل حيوي معقم جديد يحتوي على PBS طازج مضاف إليه 10%FBS و 10%Pen strep، مع التأكد من ملء حلقة التروية بالكامل وجميع خطوط الممرات الهوائية بالسائل. ومن هذه النقطة فصاعداً، سيتم استخدام مضخة نبضية لتروية الرئتين بمعدل خمسة مليمترات في الدقيقة.

قم بتعقيم سِقالة المصفوفة خارج الخلية للرئة عن طريق التروية طوال الليل باستخدام PBS يحتوي على 10% FBS و 10% penicillin streptomycin. بعد إتمام هذه الخطوة، انقل الرئتين إلى حضانة بدرجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة أو حتى تتوازن درجة الحرارة. وتحضيراً للمعالجة باستخدام Ben Nase، فإن الخطوة التالية هي معالجة الرئتين بـ Ben Nase.

لإزالة بقايا DNA من كل رئة، ابدأ بملء حقنة سعة 10 milliliter بمحلول Ben Nase buffer المسخن مسبقاً فقط، وحقنة أخرى سعة 10 milliliter بتركيز 90 units per milliliter من Ben Nase المخفف في Ben Nase buffer. أوقف عملية تروية الرئتين.

بعد ذلك، قم بنفخ الممرات الهوائية باستخدام محلول Ben Nase المنظم مع تجنب حقن الهواء في الرئة. اترك الرئة لتفرغ من الهواء لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بنفخ الرئة باستخدام محلول Ben Nase.

ومرة أخرى، يجب توخي الحذر لعد 통한 إدخال الهواء إلى الرئة بعد نفخها باستخدام Ben Nase. تُترك الرئتان دون تروية أو تهوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وفي نهاية الساعة، يتم استئناف التروية باستخدام PBS مضافاً إليه 10%FBS و10%penicillin streptomycin الموجود بالفعل في المفاعل الحيوي، وتستمر التروية طوال الليل وحتى اليوم التالي.

بعد الشطف والتعقيم، يمكن تحضير سِقالة المصفوفة خارج الخلوية الطويلة لإعادة استيطان الخلايا. استبدل محلول P-B-S-F-B-S benzo بـ 250 milliliters من وسط الزرع. يتم التروية لـ Medium لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إدخال الخلايا، ويُستبدل بوسط زرع جديد مباشرة قبل استزراع الخلايا.

يمكن الاستعانة بالعديد من المصادر الخلوية لإعادة بناء الأعضاء. وفي هذا العرض، سيتم توضيح عملية الترقيع باستخدام مجموعة من الخلايا الظهارية. أولاً، قم بتحضير حقنة تحتوي على 15 milliliters من معلق خلوي من مجموعة الخلايا الظهارية المطلوبة.

بعد ذلك، املأ خزان المجرى الهوائي بـ 80 milliliters من وسط الزرع وتأكد من خلو جميع خطوط التهوية من الهواء. ثم ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وقم بتوصيل مضخة الحقنة للتهوية. ازرع الخلايا في الرئتين باستخدام دفعة واحدة سريعة عن طريق حقن 15 milliliter من معلق الخلايا في القنية الرغامية.

تأكد من إغلاق فلاتر الهواء في المفاعل الحيوي الرئيسي بإحكام. بعد ذلك، ابدأ على الفور بعملية سحب هواء واحدة بطيئة باستخدام مضخة حقنة لسحب 60 milliliters من الهواء من المفاعل الحيوي الرئيسي بمعدل 3 milliliters في الدقيقة. ستستغرق هذه العملية 20 دقيقة تقريبًا.

اترك الرئتين في حالة سكون لمدة 18 ساعة تقريباً بعد ذلك. ابدأ التروية الوعائية البطيئة بمعدل 0.5 milliliters per minute تقريباً. وخلال استزراع الأعضاء، يتم إجراء التروية عادةً بمعدل one to three milliliters per minute.

عند استخدام مضخة أسطوانية (roller pump) أثناء استزراع الخلايا الطلائية، يتم توفير التهوية عادةً بمعدل مستمر يبلغ نفساً واحداً في الدقيقة وبحجم جاري يتراوح بين 5 إلى 10 milliliters. أما عند استخدام مضخة حقنة، فيتم سحب الهواء وحقنه بشكل دوري في المفاعل الحيوي لمحاكاة عملية التنفس من خلال التناوب بين الضغط السلبي والضغط الجوي داخل الغرفة الرئيسية. ونظراً للحاجة إلى الحفاظ على إحكام إغلاق المفاعل الحيوي أثناء التهوية، يجب إيقاف التهوية يومياً واستبدال الهواء الموجود في الغرفة الرئيسية.

بالإضافة إلى ذلك، يجب تغيير الوسط كل ثلاثة إلى أربعة أيام تقريبًا. وأثناء عملية الاستزراع، ينبغي استبدال نصف الحجم الإجمالي تقريبًا في كل مرة عند استزراع الظهارة الرئوية والبطانة الوعائية. ومن خلال السقالة المثبتة داخل المفاعل الحيوي، تمكنا من توليد نسيج رئوي قادر على المشاركة في تبادل الغازات لفترات زمنية قصيرة.

يظهر هنا صبغ الـ hematoxylin and eosin القياسي لرئة جرذ طبيعية للمقارنة مع صبغ الـ H and E لرئة جرذ منزوعة الخلايا. يجب أن تكون المصفوفة خارج الخلوية النهائية منزوعة الخلايا خالية تماماً من المواد الخلوية، مع الاحتفاظ بالخصائص العيانية والمجهرية والبنيوية الدقيقة للرئة الطبيعية. سيتيح صبغ الـ h and e رؤية أي بقايا من الـ DNA، العالقة بالسقالة نتيجة لعدم كفاية عملية نزع الخلايا أو الشطف، وهي ظروف ضرورية لضمان الظروف المثالية لاستزراع الخلايا والزراعة اللاحقة للرئة.

ويجب أن ينتج عن المفاعل الحيوي خلايا موزعة جيدًا داخل جميع فصوص الرئة الخمسة، كما يجب أن يوفر تغطية تبلغ حوالي 70% من سِقالة المصفوفة خارج الخلية. تقارن هذه الصور بين الرئة الأصلية والرئة المعاد استيطانها عند صبغها بالفلورة المناعية. وبالنسبة لعلامات الرئة الرئيسية، فإن الخلايا المستزرعة تكون إيجابية لبروتين إفراز خلايا كلارا pro secretory protein C وبروتين Aquaporin five.

تظهر العلامات المستهدفة باللون الأحمر، بينما تظهر النوى المصبوغة بـ DAPI باللون الأزرق في جميع اللوحات. وبمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إتمام العملية من إزالة الخلايا إلى استعادة الشكل في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح.