الداخلي للهندسة الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد أنسجة الرئة في الثقافة التي يمكن مقارنتها شكليا وفسيولوجيا بأنسجة الرئة الأصلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد القلب والرئتين أولا من فأر بالغ. الخطوة التالية هي قنية الشريان الرئوي والقصبة الهوائية وتوصيل الرئتين المعلقة بمفاعل حيوي لإزالة الخلايا.

بعد إزالة الخلايا والشطف ، يتم نقل الرئة إلى مفاعل حيوي معقم للزراعة وإعدادها للجلوس. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي زرع الحجرة المرغوبة من الرئة بمجموعة خلايا جاهزة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر المصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا التي أعيد ملؤها بكفاءة بالخلايا التي تعبر عن علامات الرئة المحددة إقليميا من خلال الفحص المجهري المناعي الفلوري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لزراعة خلايا الرئة في المختبر هي أن الخلايا تحافظ على أنماط ظاهرية متمايزة لفترة طويلة من الزمن ، بحيث يمكن دراستها لعدة أسابيع في ركيزة ثلاثية الأبعاد مشتقة بيولوجيا. لإزالة الخلايا ، يتم توصيل الرئتين بغطاء المفاعل الحيوي عبر قنية الأوعية الدموية ، ويتم توصيل الغطاء بجهاز إزالة الخلايا. يتم تثبيت الزجاجة فوق الرئتين في مكانها بواسطة حامل حلقات ومشبك متصل.

في هذه المرحلة ، يمكن إزالة المواد الخلوية لإنتاج سقالة مصفوفة خارج الخلية ، والتي يمكن إعادة ملؤها بالمواد الخلوية. يظهر في هذا الرسم البياني تجميع المفاعل الحيوي لبذر وزراعة أنسجة الرئة المهندسة هندسيا. يتصل موصل قفل الإغراء لقنية القصبة الهوائية بحلقة تنفس بين خزان القصبة الهوائية والغرفة الرئيسية.

تشتمل حلقة التنفس على صمامين أحادي الاتجاه. المواضع مثل هذا الوسيط يتبع مسارا مختلفا داخل وخارج الرئة. يتم دمج خزان صغير مؤقتا في خط التروية لبذر الخلايا البطانية.

تستخدم مضخة نابضة لنقل الخلايا من الخزان إلى حجرة الأوعية الدموية في الرئة. يتم توفير نضح الأوعية الدموية باستخدام مضخة أسطوانية. يتم تنفيخ الوسط في الشريان الرئوي عبر القنية المرفقة ، ويتدفق عبر الأوعية الدموية الرئوية ويخرج من الوريد الرئوي مباشرة إلى المفاعل الحيوي الرئيسي حيث يتم سحب الوسط للتروية.

تجلس الظهارة الرئوية عن طريق الحقن في حلقة التنفس. تستخدم الغرفة الرئيسية التي تحتوي على الرئة وخزان القصبة الهوائية لزراعة الرئة على المدى الطويل. عندما يتم استخراج الرئتين وتعقيم الشريان والقصبة الهوائية بشكل صحيح ، يجب أن تحتفظ الرئتان المستخرجة حديثا بالهواء دون تسرب.

يمكن التحقق من ذلك عن طريق نفخها بالهواء أثناء غمرها في السائل. يجب ألا يكون هناك أي فقاعات تشير إلى تسرب الهواء. لبدء البروتوكول ، يتم نفخ الرئتين باستخدام PBS الذي يحتوي على جانب نيتروبريس الصوديوم حتى تمتلئ الرئتان ولكن لا يتم تضخيمها على الفور ، وتغطية قنية القصبة الهوائية بحيث تظل الرئتان منتفختين.

بعد ذلك ، قم بتدمير الرئتين باستخدام PBS و SNP لمدة 15 دقيقة على الأقل عند 15 ملم من الزئبق. بعد ذلك ، قم بإزالة السدادة من قنية القصبة الهوائية للسماح للرئتين بالانكماش. استمر في التروية باستخدام PBS و SNP لمدة 15 إلى 30 دقيقة إذا لزم الأمر.

أعد تعبئة PBS و SNP لضمان الحفاظ على ضغط الوفرة عند 10 إلى 15 ملم من الزئبق. لبدء إجراء إزالة الخلايا لفترة طويلة ، يتم توصيل غطاء المفاعل الحيوي بجهاز إزالة الخلايا. ثم يتم توصيل الرئتين بالغطاء.

باستخدام وصلات قفل الإغراء المرتبطة بالقنية على شكل YS ، يجب أن تتصل قنية الشريان الرئوي بخط التروية ويجب أن تطفو قنية القصبة الهوائية بحرية. لضمان إزالة الخلايا الكاملة من الأنسجة ، من الضروري إبعاد الهواء عن النظام. تساعد الصمامات أحادية الاتجاه في قنية الشرايين والقصبة الهوائية على إزالة فقاعات الهواء في الأنبوب من خلال تمكين التدفق العكسي في الأنبوب.

لذلك ، مما يسمح بإزالة فقاعات الهواء عن طريق المحقنة ، تأكد من خلو جميع الخطوط من الهواء. ابدأ التروية بمحلول إزالة الخلايا. ممتلئة بمحلول إزالة الخلايا.

حتى يتم تخلل 500 مل من المحلول عبر الرئتين ، يكون الضغط الأمثل أقل من 15 ملم من الزئبق. سيتطلب هذا عادة 2.5 ساعة. عادة ما تكون معدلات التدفق بطيئة جدا في البداية وتزداد بسرعة خلال الساعة الثانية إلى ما يقرب من مليلتر واحد في الدقيقة أو أكثر.

أثناء إزالة التروية بشكل دوري ، استخدم سائل إزالة الخلايا من المفاعل الحيوي مع ضمان بقاء ما يكفي من السوائل لدعم قنية الرئة والقصبة الهوائية. عند اكتمال التروية بسائل إزالة الخلايا ، انقل الرئتين والمفاعل الحيوي إلى غطاء زراعة الأنسجة. لبدء شطف الأعضاء ، قم بإزالة البرطمان سعة 500 مل الذي يحتوي على سائل إزالة الخلايا واستبدله بوعاء معقم يحتوي على ما يصل إلى لتر واحد من PBS المعقم.

استخدم شفط فراغ أو حقنة للتأكد من خلو الخطوط من نفخ الهواء PBS من خلال الأوعية الدموية عند 10 إلى 15 ملم من الزئبق بنفس الطريقة. بالنسبة لإزالة الخلايا ، باستخدام تقنيات معقمة ، قم بإزالة نفايات PBS بشكل دوري من المفاعل الحيوي واستبدال أو إعادة ملء جرة PBS. مع PBS الطازج والمعقم ، استمر في الشطف حتى يتخلل 2.5 لتر على الأقل من PBS المعقم الرئتين.

سيستغرق ذلك عادة يومين من بداية عملية إزالة الخلايا عند اكتمال الشطف. انقل الرئتين إلى نظام مفاعل حيوي معقم جديد يحتوي على PBS جديد بالإضافة إلى 10٪ FBS بالإضافة إلى 10٪ Pen Strep يضمن ملء كل من حلقة التروية بأكملها وخطوط مجرى الهواء بأكملها بالسوائل. من هنا فصاعدا ، سيتم استخدام مضخة نابضة لنقل الرئتين بسرعة خمسة ملليمترات في الدقيقة.

تعقيم سقالة مصفوفة الرئة خارج الخلية عن طريق التروية الليلية باستخدام PBS الذي يحتوي على 10٪ FBS و 10٪ بنسلين ستربتومايسين. بعد الانتهاء من هذه الخطوة ، انقل الرئتين إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو حتى يتم توازن درجة الحرارة. استعدادا للعلاج ب Ben Nase ، فإن الخطوة التالية هي علاج الرئتين باستخدام Ben Nase.

لإزالة الحمض النووي المتبقي لكل رئة ، املأ أولا حقنة واحدة سعة 10 مليلتر بمخزن Ben Nase المؤقت Prewarm فقط ، وحقنة واحدة سعة 10 مليلتر مع 90 وحدة لكل مليلتر. تم تخفيف بن ناس في عازلة بن ناس. وقف نضح الرئتين.

ثم قم بتضخيم مجرى الهواء باستخدام عازلة Ben Nase مع تجنب حقن الهواء في الرئة. اسمح للرئة بالانكماش لمدة دقيقة واحدة. ثم نفخ الرئة بمحلول Ben Nase.

مرة أخرى ، الحرص على عدم إدخال الهواء إلى الرئة بعد النفخ باستخدام Ben Nase. اسمح للرئتين بالجلوس دون تروية أو تهوية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في نهاية ساعة واحدة ، استأنف التروية باستخدام PBS بالإضافة إلى 10٪ FBS 10٪ بنسلين ستربتومايسين الموجود بالفعل في المفاعل الحيوي ، واستمر في التروية طوال الليل في اليوم التالي.

بعد الشطف والتعقيم ، يمكن تحضير سقالة المصفوفة الطويلة خارج الخلية لإعادة التوطين الخلوي. استبدل محلول P-B-S-F-B-S BENZO A ب 250 مل من الثقافة. بيرفو متوسط لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إدخال الخلايا واستبداله بوسط استزراع جديد مباشرة قبل بذر الخلايا.

يمكن استخدام العديد من مصادر الخلايا لانحسار الأعضاء. هنا ، سيتم عرض الجلوس مع مجموعة من الخلايا الظهارية. أولا ، قم بإعداد حقنة تحتوي على 15 مل من تعليق الخلية لمجموعة الخلايا الظهارية المطلوبة.

بعد ذلك ، املأ خزان مجرى الهواء ب 80 مل من وسط الزراعة وتأكد من خلو جميع خطوط التهوية من الهواء. ثم ضع المفاعل الحيوي في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتوصيل مضخة الحقنة للتهوية. زرع الخلايا في الرئتين باستخدام بلعة سريعة واحدة عن طريق حقن معلق الخلية 15 مليلتر في قنية القصبة الهوائية.

تأكد من تغطية فلاتر الهواء في المفاعل الحيوي الرئيسي. ثم ابدأ على الفور في التنفس البطيء باستخدام مضخة المحقنة لسحب 60 مل من الهواء من المفاعل الحيوي الرئيسي بمعدل ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. سيستمر هذا لمدة 20 دقيقة تقريبا.

أ السماح للرئتين بالجلوس بشكل ثابت لمدة 18 ساعة تقريبا بعد ذلك. ابدأ نضح الأوعية الدموية البطيء بحوالي 0.5 مل في الدقيقة. أثناء زراعة الأعضاء ، يتم إجراء التروية عادة من واحد إلى ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.

باستخدام مضخة أسطوانية أثناء زراعة الظهارة ، يتم توفير التهوية عادة بمعدل مستمر من نفس واحد في الدقيقة وحجم المد والجزر من خمسة إلى 10 ملليلتر. يتم سحب الهواء باستخدام مضخة المحقنة بشكل دوري وحقنها في المفاعل الحيوي للتأثير على التنفس بالتناوب بين الضغط السلبي والضغط الجوي داخل الغرفة الرئيسية. نظرا للحاجة إلى الحفاظ على المفاعل الحيوي محكم الإغلاق أثناء التهوية ، يجب إيقاف التهوية مؤقتا يوميا وتبادل الهواء في الغرفة الرئيسية.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب تغيير الوسيط كل ثلاثة إلى أربعة أيام تقريبا. أثناء الاستزراع ، يجب استبدال ما يقرب من نصف الحجم الكلي في كل مرة عن طريق زراعة الظهارة الرئوية وبطانة الأوعية الدموية. داخل السقالة المثبتة على المفاعل الحيوي ، نحن قادرون على توليد أنسجة رئوية قادرة على المشاركة في تبادل الغازات لفترات زمنية قصيرة.

عرض صبغة الهيمات القياسية والتوين والإيوين لرئة الفئران الأصلية هنا للمقارنة مع صبغة H و e لرئة الفئران منزوعة الخلايا. يجب أن تكون المصفوفة النهائية خارج الخلية خالية تماما من المواد الخلوية وتحتفظ بالخصائص الإجمالية والمجهرية والهيكلية الفائقة للرئة الأصلية. ستمكن صبغة h و e من تصور أي حمض نووي متبقي ، والالتصاق بالسقالة نتيجة لعدم كفاية إزالة الخلايا أو شطف الظروف المثلى لتلقيح الخلايا والثقافة اللاحقة للرئة.

ويجب أن ينتج عن المفاعل الحيوي خلايا موزعة جيدا داخل جميع الفصوص الخمسة للرئة ويجب أن يوفر تغطية لما يقرب من 70٪ من سقالة المصفوفة خارج الخلية. تقارن هذه الصور الرئة الأصلية بالرئة المعاد تعبئتها عند تلطيخها بالتألق المناعي. بالنسبة لعلامات الرئة الرئيسية ، فإن مجموعة الخلايا المستزرعة إيجابية للبروتين الإفرازي لخلية كلارا البروتين الإفرازي C و Aquaporin five.

علامات الاهتمام باللون الأحمر والنوى الملطخة ب DAPI باللون الأزرق في جميع الألواح. بمجرد إتقان هذا الإجراء من إزالة الخلايا إلى الانحسار ، يمكن إجراؤه في غضون أربعة إلى خمسة أيام إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.