قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

يعد اختبار زرع الخلايا المخففة المحدد هو المعيار الذهبي لتقييم إمكانات التجديد الذاتي في النماذج الحيوانية التجريبية. في هذا العرض التوضيحي ، يتم حقن أجنة الزرد المتزايقة في مرحلة خلية واحدة بقطعة قماش اثنين من MIC و RAG اثنين من GFP لإنشاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي ستطور سرطان الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية المسمى فلورسنت. بحلول 60 يوما من العمر ، يتم عزل خلايا سرطان الدم الأولية من أسماك الزرد ثم يتم تنقيتها باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

بعد ذلك ، يتم زرع الخلايا للحد من التخفيف في التجويف البريتوني لأسماك الزرد البالغة ، ويتم مراقبة الأسماك لنمو الورم لمدة تصل إلى 90 يوما. أخيرا ، يتم استخدام البرنامج الإحصائي لتحليل التخفيف المحدد للغاية لتحديد تواتر انتشار خلايا سرطان الدم داخل الورم الأصلي. يسمح الحد من تحليل زرع الخلايا المخففة للباحثين بإجراء تقييم دقيق لعدد الخلايا ذاتية التجديد الموجودة في الجزء الأكبر من كتلة الورم.

هذه الخلايا ذاتية التجديد هي التي تدفع تكوين السرطان وهي المسؤولة في النهاية عن الانتكاس. الميزة الرئيسية لإجراء فحوصات زرع التخفيف المحدودة في نموذج أسماك الحمار الوحشي هي أنه يمكن زرع العديد من الأسماك لكل تجربة ، مما يؤدي إلى دقة أفضل عند تحديد تواتر خلايا تكاثر الورم ذاتية التجديد. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للخلايا التكاثرة للورم في الخلايا التائية ، وهي ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد.

يمكن تطبيقه أيضا لفهم نماذج سرطان الزرد الأخرى. ستقوم جيسيكا بلاكبيرن ، الزميلة في المختبر وسالي ليو ، وهي فنية موهوبة ، بتوضيح الإجراء لك اليوم لخطية Rag two CM و RAG اثنين G-F-P-D-N-A تهضم 10 ميكروغرامات من كل بلازميد مع إنزيم تقييد ، وليس واحدا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد استخراج كلوروفورم الفينيل وهطول الإيثانول ، نعلق كل بلازميد في 20 ميكرولتر من الماء.

حدد تركيزات الحمض النووي على هلام زراعي بنسبة 1٪ عن طريق تشغيل تخفيف واحد لواحد ، واحد إلى خمسة ، وواحد إلى 10 لكل بلازميد مهضوم مع 20 ميكرولتر و 10 ميكرولتر وخمسة ميكرولترات من سلم الحمض النووي عالي المدى. الآن قم بتخفيف الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 60 نانوغرام لكل ميكرولتر للحقن في CG ، سلالة واحدة. تقوم أجنة الزرد بحقن 250 نانولتر من 30 نانوغرام لكل قطعة قماش ميكرولتر و سنتيمترين و 30 نانوجرام لكل ميكرولتر.

قم بتقطيع اثنين من GFP في مرحلة خلية واحدة ، وتستهدف بعناية الحمض النووي مباشرة في الخلية وليس في صفار البيض. قم بتخزين الأجنة المحقونة عند 28.5 درجة مئوية وإزالة الأجنة الميتة بعد 24 ساعة بعد خمسة أيام من العمر ، ونقل إلى خزانات كبيرة بعد 28 يوما تقريبا من الحقن. سمك الزرد اليرقي المخدر عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من أربعة نانوغرام لكل مليلتر trica S إلى 25 مل من ماء نظام الأسماك في طبق بتري.

افحص اليرقات لتطوير TALL المسمى بالفلورسنت باستخدام مجهر مضان epi للكشف عن مضان GFP. افصل اليرقات الإيجابية للورم عن تلك السلبية لضمان عدم تفويت أي أسماك سرطان الدم في التحليل. يمكن فحص اليرقات السالبة في وقت لاحق بمجرد أن تنمو الأورام بشكل أكبر راقب أسماك سرطان الدم المصنفة بالفلورسنت مرة واحدة على الأقل في الأسبوع باستخدام مجهر التألق الموسع لتتبع نمو الورم.

عندما تتفوق خلايا سرطان الدم الإيجابية GFP على أكثر من 50٪ من ، أضف ملليلتر واحد من أربعة نانوغرام لكل ملليلتر. Trica S في طبق بتري يحتوي على تسعة ملليلتر من ماء نظام السمك للتضحية بالأسماك ، ضع السمك في طبق بتري جديد يحتوي على ملليلتر واحد من مصل الأبقار الجنيني بنسبة 5٪ في 0.9 XPBS ينقع السمك بشفرة حلاقة ، ويبيت الخليط لفصل كتل الخلايا الكبيرة. ثم مرر الخلايا عبر مصفاة شبكية 40 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل.

ماصة 500 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب بوليسترين سعة أربعة ملليلتر. أضف ميكرولتر واحد من مليغرام واحد لكل مليلتر ، يوديد البيريديوم لتسمية دوامة الخلايا الميتة ، ثم احتفظ بالخلايا على الجليد. قم أيضا بإعداد سمكة CG من النوع البري لجمع خلايا الدم الطبيعية ، والتي تعمل كناقل للخلايا السرطانية أثناء الزرع عند أربعة ملليلتر من 5٪ FPS في 0.9 × PB S إلى أنبوب 50 مليلتر لحجم إجمالي يبلغ خمسة ملليلتر.

عد خلايا الدم الطبيعية المخففة إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في 5٪ FBS في 0.9 × pbs ثم ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئر باستخدام فارز الخلايا المنشطة الفلورية ، فرز الخلايا السرطانية السلبية PI الإيجابية GFP في لوحة البئر 96 التي تحتوي على خلايا الدم بالجرعات المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بفرز 10000 خلية في بئر بدون خلايا دم طبيعية وأعد تحليلها باستخدام الحقائق لتقييم نقاء وصلاحية أجهزة الطرد المركزي للخلايا التي تم فرزها. لوحة البئر 96 في 2000 GS لمدة 10 دقائق لتبيير الخلايا.

قم بإزالة 95 ميكرولترا من snat وأعد تعليق الخلايا في الميكرولترات الخمسة المتبقية. حقن معلق الخلية في التجويف البريتوني لأسماك الزرد الزاد البالغة التي يزيد عمرها عن 60 يوما باستخدام حقنة صغيرة قياس 26 ونصف. لا يلزم تخدير أسماك الزرد قبل الزرع.

زرع 45 سمكة مع 10 خلايا سرطان الدم ، و 20 سمكة مع 100 خلية ، وسبع أسماك مع 1000 خلية وخمس أسماك مع 10،000 خلية طويلة بعد حوالي 28 يوما من الزرع. فحص أسماك الحمار الوحشي المتلقية بمجهر مضان epi باستخدام طول موجي للإثارة 4 85 20 ومرشح انبعاث 5 30 25. للكشف عن مضان GFP.

سجل عدد الأسماك الموجبة لكل عدد إجمالي من الأسماك المحقونة. أعد فحص الأسماك كل 14 يوما لما يصل إلى 90 وسجل عدد الأسماك الإيجابية. عندما تصبح الأسماك إيجابية الورم أكثر وفرة.

التضحية بالحيوان عن طريق جرعة زائدة من trica US ، وأدخل النتائج في جدول وقم بتحميل البيانات في برنامج تحليل التخفيف المحدد للغاية المستند إلى الويب لتحديد تواتر خلايا سرطان الدم ذاتية التجديد داخل أجنة TALL CG الأولية التي تم حقنها ب RAG two cmic و RAG تم فحص يرقة GFP من أجل الطول الأولي بعد 28 يوما بما يتفق مع العمل السابق ، ما يقرب من 5٪ من الأسماك المحقونة تحتوي على خلايا تائية إيجابية GFP داخل الغدة الصعترية ، و 100٪ من هذه الأسماك ستصاب بسرطان الدم. هنا ، تم فرز الخلايا الطويلة المصنفة بالفلورسنت من المريضة التي يبلغ عمرها 65 يوما واستخدامها في مقايسة زرع الخلايا المخففة المحدودة. أولا ، تم رسم مشية لتحديد الخلايا المفردة.

ثم تم اختيار الخلايا السالبة بيوديد البروبيديوم. وأخيرا تم رسم مشية لاختيار خلايا سرطان الدم الإيجابية GFP فقط للفرز. في هذا المثال من الأسماك المزروعة بطول القامة في اليوم 28 ، شوهدت الأورام في المرحلة المبكرة على أنها منطقة من الخلايا الإيجابية ل GFP بالقرب من موقع الحقن.

في حين أن بعض TLS كانت أكثر تقدما ، بعد أن توسعت لملء التجويف البريتوني لهذه التجارب ، تم زرع أكثر من 220 ، والتي يمكن تحقيقها بسهولة بواسطة شخص واحد في غضون عدة ساعات. أظهر تحليل البيانات باستخدام برنامج elda أنه في المتوسط واحدة من كل 135 T كانت جميع الخلايا تتجدد خلايا تكاثر ابيضاض الدم ذاتيا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع الخلايا السرطانية في الحد من التخفيف في التجويف البريتوني لسمك الزرد الزلائي ، وكيفية استخدام البيانات الناتجة لتحديد تواتر الخلايا التي تنتشر الورم داخل ورم معين.

قد تساعد الدراسات الإضافية التي تستخدم المعدلة وراثيا في تحديد الآليات التي تحكم التجديد الذاتي لهذه الخلايا المتكاثرة للورم.