بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

تستخدم الفيروسات ذات الحمض النووي الريبوزي (RNA viruses) إنزيمات RNA polymerase مشفرة فيروسياً لتكرار جينوماتها. وتتميز هذه البوليميرازات بمعدل خطأ مرتفع بطبيعتها، مما يسمح للفيروس بالتكيف والتطور بسرعة. يقدم هذا الفيديو طريقة محسنة لفحص وتحديد الفيروسات التي تحمل طفرات في إنزيم RNA polymerase تؤثر على معدل الخطأ أو دقة النسخ أثناء التكرار.

أولاً، يتم تعريض الخلايا المضيفة للفيروس لمواد طافرة لتحديد أقصى مستوى من المادة الطافرة يمكن استخدامه دون قتل الخلايا أو تثبيط الفيروس. وبمجرد تحديد الظروف المثلى، يتم تمرير الفيروس تحت ضغط انتقائي من المواد الطافرة للحمض النووي الريبوزي RNA. بعد ذلك، يتم تسلسل الجمهرة المقاومة للمواد الطافرة لتحديد الطفرة المسؤولة.

بعد ذلك، يتم عزل الطفرة المقاومة للمواد المحدثة للطفرات. وتتم مراقبة حركية التضاعف، وتظهر النتائج زيادات أو نقصانات في دقة البوليميراز، وذلك بالتزامن مع مقاومة واسعة للمواد المحدثة لطفرات RNA وتغيرات في تردد طفرات الجمهرة الفيروسية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام الأحماض ذات الدقة الكيميائية الحيوية باستخدام بوليميرازات منقاة، في أن هذه التقنيات المتبعة صالحة لأي فيروس RNA يمكن استنباته في المزارع النسيجية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الفيروسات، مثل دور polymerase aate في تكيف الفيروس وتطوره. وعموماً، قد يواجه الأشخاص الجدد في استخدام هذه الطريقة صعوبات لأن الضغوط الانتقائية التي يستخدمونها تكون إما قوية جداً أو ضعيفة جداً، كما أن حجم عينة التسلسل المحللة للمنطقة المتسلسلة وعدد المستنسخات لم يتم تحسينهما لتحقيق القوة الإحصائية المطلوبة.

ابدأ هذه التجربة بتحديد نطاق تركيزات المواد الطافرة التي يمكن استخدامها في التجارب التالية دون أن تؤدي إلى موت الخلايا. قم بشفط الوسط من أطباق ذات ستة آبار تحتوي على طبقات أحادية غير متلاصقة من الخلايا السُرية. ثم أضف هنا ملي لترين من الوسط المكمل بالمادة الطافرة، وتُستخدم المواد الطافرة ribovirin و 5-Fluorouracil و 5-azacitidine و magnesium chloride و manganese chloride.

حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5% ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، وكل 24 ساعة للأيام السبعة أيام القادمة، استخدم طبقاً واحداً من الخلايا للتحقق من الحيوية عن طريق استبعاد صبغة tripan blue. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، احسب النسبة المئوية للخلايا الحية لكل تركيز من المادة المطفرة، بما في ذلك ظروف التحكم غير المعالجة التي تؤدي إلى موت الخلايا بنسبة أقل من 50% عند نقطة نهاية العدوى.

عندما يتم الوصول إلى العيارات القصوى المثالية، تتمثل الخطوة التالية من الإجراء في تحديد تركيز المادة المطفرة التي ستفرض ضغطاً انتخابياً أمثلاً دون التسبب في طفرات مفرطة للمجتمع عند التركيزات المناسبة. يتعرض كل جينوم للطفرة في موضع واحد أو موضعين على الأقل. وبذلك، ستعمل المادة المطفرة على توليد طفرة المقاومة، والتي سيتم اختيارها لاحقاً عبر عملية التمرير.

إذا تم إدخال الكثير من الطفرات، فإن الطفرات التي تحمل طفرة المقاومة ستصبح مميتة بحد ذاتها. يعيق المادة المطفرة عزلها في أطباق ذات ستة آبار مزروعة بـ he. تُستخدم خلايانا في 2 mL من الوسط المكمل بالمادة المطفرة نفس نطاق التركيزات المستخدم سابقاً، مع استبعاد التركيزات التي أدت إلى موت الخلايا بنسبة تتجاوز 50%.

تُحضن العينات لمدة ساعتين للسماح بامتصاص المادة المطفرة بعد عملية التحضين. يتم سحب الوسط الغذائي ثم تُعدى الخلايا بالفيروس بمعدل عدوى منخفض في 200 µL، وتُحضن لمدة تتراوح من 15 إلى 60 دقيقة للسماح للفيروس بإصابة الخلايا، مع هز الطبق على فترات منتظمة لضمان تغطية اللقاح لطبقة الخلايا الأحادية. يتم سحب الفيروس الملقح والغسل مرتين باستخدام 2 mL من PBS لإزالة أكبر قدر ممكن من اللقاح.

بعد ذلك، أضف الوسط الذي يحتوي على المادة المطفرة إلى كل بئر، واحضر الخلايا لمدة تعادل ثلاث إلى ست دورات تضاعف، وتتراوح عادةً من يومين إلى سبعة أيام. اجمع الفيروس من كل بئر وأجرِ مقايسة اللويحات القياسية أو التخفيف المحدود لتحديد التأثير المضاد للفيروسات على عيار الفيروس من العيارات المحسوبة. حدد تركيز المادة المطفرة الذي يخفض عيارات الفيروس بمقدار 0.5 إلى لوغاريتمين مقارنة بمجموعة التحكم المصابة غير المعالجة، وبشرط ألا يكون شديد السمية للخلايا.

يُفضل أن تكون السمية أقل من 50% لعزل المتغيرات المقاومة للمواد المطفرة. ابدأ بتمرير الفيروس في خلايا HeLa باستخدام التركيز الأمثل من كل مادة مطفرة، وقد يحتاج الفيروس إلى التمرير حتى 30 مرة؛ وفي كل تمريرة، قم بقياس عيار الفيروس وتكرار عملية العدوى والحضانة مع المادة المطفرة كما هو موضح هنا. يجب أن تنخفض عيارات الفيروس في العينات المعالجة بالمطفرات خلال التمريرات القليلة الأولى مقارنة بعيار الفيروس الأصلي وعيارات الفيروس في مجموعة التحكم غير المعالجة. وبمجرد وصول عيارات الفيروس لسلسلة معينة إلى نفس مقدار عيارات مجموعة التحكم غير المعالجة، فإن ذلك يشير إلى حدوث مقاومة.

استخلص الحمض النووي الريبي (RNA) الفيروسي لغرض التسلسل باستخدام بادئات تعمل على تضخيم جينات البوليميراز أو جينات التكرار للفيروس المستهدف. قم بتوليد الحمض النووي الريبي المتمم (CDNA) للجينوم الفيروسي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (R-T-P-C-R)، ثم قم بتسلسل الحمض النووي (DNA). وبمجرد الحصول على معلومات التسلسل.

استخدم برنامج محاذاة لمحاذاة التسلسلات الناتجة مع التسلسل المرجعي المجمع وتحديد الطفرات النقطية الجديدة. بالإضافة إلى ذلك، افحص مخططات الكروماتوغرافيا بحثاً عن القمم الثانوية التي قد يكون برنامج المحاذاة قد أغفلها؛ حيث إن الطفرة التي تمثل 20 إلى 30% من إجمالي الجمهرة ستظل تظهر كقمة، ولكنها تكون أصغر من أن يتم تحديدها كنيوكليوتيد مختلط بواسطة تحليل التسلسل القياسي. ولتحديد الطفرة المستهدفة، ابحث عن تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة التي تظهر حصرياً في الجمهرة المعالجة بمادة مطفرة مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة من نفس الممر كما هو موضح هنا. وبمجرد تحديد الطفرة، يجب إعادة توليد المتغير المقاوم من cDNA معدٍ أو عزله في المزارع النسيجية، ومن ثم تأكيد النمط الظاهري للمقاومة.

سنقوم هنا باستخدام مقايسة اللويحات لعزل الطفرات المحددة. قم بتحضير تخفيفات متسلسلة من العينة المقاومة للنيتروجين وأضفها إلى طبقات أحادية من الخلايا في أطباق ذات ستة آبار لإجراء مقايسة اللويحات، وذلك بعد تحضينها لمدة ساعة واحدة عند 37 °C و5% carbon dioxide. أضف طبقة تغطية من الأغاروز بعد يومين إلى خمسة أيام من العدوى.

يجب أن تكون اللويحات مرئية بوضوح. ومن الناحية المثالية، سينتج أحد الأطباق ما بين 10 و 50 لويحة منفصلة جيداً. حدد موقع اللويحات على الطبق بنقطة باستخدام قلم تحديد، مع مراعاة عدم تحريك أو إزاحة الطبقات التراكبية، وذلك بغرس طرف مرشح P 200 برفق عبر الطبقة التراكبية من الآجار.

للوصول إلى اللويحة، ارفع السن بعناية من الطبقة الفوقية وانقل سدادة aros إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 250 microliters من الوسط الغذائي. سيتم نقل كمية كافية من الفيروس بغض النظر عما إذا كانت سدادة aros قد تحررت من السن؛ قم بخلط الأنبوب باستخدام جهاز vortex لضمان الحصول على تركيز يصل إلى TenX لكل علاج per ute. احتفظ بجزء من العينة لتضخيم الفيروس الحي لاحقاً.

بعد ذلك، قم باستخلاص الـ RNA من المتبقي من العينة وأجرِ تفاعل R-T-P-C-R لتحديد عينة اللويحة التي تحتوي على الطفرة المطلوبة. ثم قم بتسلسل الـ CDNA، وتأكد من عدم وجود طفرات إضافية.

بعد ذلك، قم بإعداد مخزون أكبر من هذا الفيروس لجميع الدراسات اللاحقة. ثم، وللتأكد من المقاومة التي تمنحها الطفرة المحددة، كرر مقايسة المادة المطفِّرة باستخدام عدة ظروف تطفيرية.

إذا كان المتغير مقاومًا لمطفرات متعددة، فمن المرجح أن يكون لديه دقة متزايدة. ونظرًا لأن الطفرات التي تغير الدقة تتركز في إنزيم البوليميراز، فمن المهم التأكد من أن حركية التضاعف لم تتغير بشكل ملحوظ. وقبل تحديد ترددات الطفرات، يجب فحص عملية التضاعف باستخدام نهجين متكاملين على الأقل.

على سبيل المثال، يمكن إجراء نهج يفحص إنتاج الفيروس مثل مقايسة اللويحات (plaque assay) أو الجرعة المعدية في المزرعة من 50% (TCID 50)، بالإضافة إلى نهج يفحص تخليق الـ RNA مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي (quantitative R-T-P-C-R) أو تحليل نورن (northern blot). بعد ذلك، وللتأكد من أن تغيير البوليميراز المحدد الذي يمنح المقاومة للمطفرات يؤثر على التكرار، يتم قياس ترددات طفرات الدقة. ويمكن إجراء ذلك إما على مجموعة الفيروسات القابلة للحياة أو على إجمالي مجموعة الفيروسات.

لتحديد ترددات الطفرات في مجتمع الفيروس الإجمالي، والذي يشمل المتغيرات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة، يتم استخلاص الـ RNA وإجراء تضخيم بواسطة R-T-P-C-R لمنطقة تتراوح بين 800 إلى 1, 200 نيوكليوتيد من تسلسل مشفر يُعرف بوجود متغيرات جينية فيه، مثل التسلسل المشفر لبروتين بنيوي. بعد ذلك، يتم إجراء topo TA clone للمنتج المنقى لكل مجتمع فيروسي يراد دراسته. ثم يتم اختيار 96 مستعمرة تم تحديدها على أنها تحتوي على قطعة مدرجة إيجابية عن طريق الفرز الأزرق والأبيض على أطباق مطلية بـ xga.

أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمستعمرات المنفردة للتأكد من صحة الفرز الأزرق والأبيض. باستخدام حجم القطعة والظروف المذكورة أعلاه، يجب أن تكون حوالي 90% من المستعمرات إيجابية. وبالنسبة لكل مستعمرة بيضاء إيجابية، استخدم عود أسنان لنقل كل مستعمرة إلى 1 mL من وسط LB في طبق 96.

يتم تحضين أطباق المزارع البكتيرية طوال الليل عند 37 °C مع الرج المستمر. وفي اليوم التالي، يتم عزل الـ DNA عن طريق تحضير mini preps بتنسيق 96 Well، ثم يتم تسلسل كل طبق باستخدام بادئات كافية للحصول على أقصى تغطية للجزء المستنسخ.

يجب أن يكون بادئان بتغطية تبلغ 600 قاعدة كافيين. قم بإجراء تحليل التسلسل باستخدام تسلسل مرجعي أو تسلسل توافقي لكل مجموعة سكانية وبرنامج محاذاة مناسب يمكنه تحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة بسهولة هنا. ابحث عن برنامج man من DNA star laser.

يُستخدم الجين أولاً لاستبعاد التسلسلات ذات الجودة المنخفضة، مثل تلك التي تعاني من رداءة في تحديد القواعد عند النهايات أو تلك التي تكون قصيرة الطول بشكل مفرط. يتم بعد ذلك محاذاة التسلسلات المتبقية، ثم تحديد نطاق النيوكليوتيدات الذي تغطيه جميع التسلسلات الداخلة في التحليل.

تخلص من المستنسخات التي لا تغطي هذه المنطقة بشكل كامل. ولأغراض المقارنة، من الضروري أن تكون المنطقة نفسها مغطاة بالكامل. حدد واحسب تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة التي تختلف عن السلالة المرجعية.

احسب تردد الطفرات عن طريق قسمة العدد الإجمالي لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة على العدد الإجمالي للنوكليوتيدات التي تم تسلسلها. قم بتمثيل هذا الرقم كمتوسط عدد الطفرات لكل 10,000 نوكليوتيد تم تسلسلها. وفي حال ظهور تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة نفسه في عدد كبير من المستنسخات، قم بتقديم قيمتين، إحداهما تتضمن هذه الطفرات المتكررة والأخرى تستثنيها.

تحديد توزيع الطفرات. قم بإعداد قائمة مرتبة لعدد النسائل في كل مجتمع التي تظهر 0، 1، 2، 3 وهكذا من الطفرات. الطفرات في المنطقة التي تم تسلسلها كخيار إضافي.

استخدم التسلسلات المُعدلة لحساب جميع المقارنات الزوجية الممكنة داخل العينة للحصول على القيم المتوسطة للتنوع السكاني. تتوفر هنا عدة برامج للمحاذاة. ويُستخدم برنامج تحليل الوراثة التطورية الجزيئية، المعروف أيضاً باسم mega، لتحديد الظروف المثلى لاختيار مقاومة الطفرات في RNA heal.

عولجت الخلايا بتراكيز متزايدة من ribovirin وحُقنت بفيروس Cox AKI B من النوع البري بتعدد عدوى قدره 0.0 1 بعد 48 ساعة من العدوى. تم حصاد الفيروسات الناتجة وتحديد العيارات بواسطة TC ID 50. يوضح هذا الشكل نسبة الخلايا التي نجت من المعالجة الموضحة أسفل محور x، والتي تم تحديدها بواسطة صبغ triam blue بعد 48 ساعة من العدوى.

تظهر النتائج أن تركيزات 100 و200 micromolar تقلل من عيار الفيروس بمقدار لوغاريتم واحد إلى اثنين دون التأثير على حيوية الخلايا. ولاختيار المجموعات المقاومة للمطفرات، تم استزراع فيروس CHI ganga في خلايا hilar بوجود (الأشرطة الرمادية) أو غياب (الأشرطة السوداء) لتركيز 50 micromolar من ribovirin، وبعد كل ممر تم قياس كمية النسل الفيروسي عن طريق مقايسة اللويحات الكلاسيكية على خلايا BHK كما هو موضح هنا. ويظهر التأثير المطفر بوضوح خلال الممرات الأولى حيث انخفض عيار الفيروس المعالج بمقدار لوغاريتمين.

عاد Titus تدريجياً إلى المستويات الطبيعية غير المعالجة. ولم تُلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في المجموعات الخمس المعالجة بالمطفرات مقارنة بالمجموعات غير المعالجة، مما يشير إلى أنه قد تم اختيار المتغيرات المقاومة. وبالفعل، حدد التسلسل طفرات فريدة في مجموعة الفيروس التي خضعت للعلاج بـ ribovirin لتأكيد المقاومة الواسعة لمطفرات RNA ذات البنى المختلفة؛ حيث تم اختبار المتغير A 3 72 V عالي الدقة من فيروس COA B three، والذي تم عزله في البداية أثناء الفحص، لمعرفة مدى انخفاض حساسيته لتركيزات مختلفة من مطفرات RNA وهي RIBOVIRIN و five fluoro uracil و five azacitidine.

تمت معالجة خلايانا بالتركيزات المحددة من ribovirin وإصابتها بفيروس Cox AKI virus B من النوع البري بتعدد عدوى قدره 0.01. وبعد 48 ساعة من الإصابة، تم جمع الفيروسات الوليدة وتحديد عياراتها بواسطة TCID₅₀. الموضح هنا هي عيارات النوع البري والمتغير a 3 72 كدالة لتركيز المادة المطفرة. وقد أظهر المتغير a 3 72 V باستمرار عيارات أعلى من النوع البري.

في جميع الظروف التي تم اختبارها لتحديد حركية النمو في خطوة واحدة لإنتاج الفيروس، تم إصابة خلايانا بتعدد عدوى قدره 10 إما بالنوع البري، أو المتغير عالي الدقة A 3 72 V، أو المتغير CX 64 ناقص التضاعف من فيروس Cox AKI virus B three. وفي النقاط الزمنية المحددة، تم جمع نسل الفيروس من الخلايا والمواد الطافية عن طريق التجميد والذوبان، ثم تم تعيين العيار باستخدام TC ID 50. ولا تتزامن زيادة الدقة في A 3 72 V مع وجود خلل ملحوظ في التضاعف في المزرعة النسيجية. بينما يظهر المتغير CX 64 تأخراً كبيراً في حركية التضاعف ويصل إلى أقصى عيارات أقل بـ 1000 ضعف من الفيروس من النوع البري.

باستخدام النهج الموضح في هذا الفيديو، فإن كل مستنسخ يتم تسلسله ينشأ من جينوم فريد ضمن مجتمع الفيروسات الكلي، وبالتالي يحمل طفرات فريدة. يوضح هذا الشكل محاذاة نموذجية بعد تنقية التسلسلات رديئة الجودة وتصور تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة. تم حساب إجمالي تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ضمن المجتمع، وتدوين عدد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة التي تظهر في كل مستنسخ.

على سبيل المثال، يحتوي المستنسخ الذي تحته خط على طفرتين فريدتين، بينما يحتوي ثمانية مستنسخات أخرى على طفرة فريدة واحدة. تُستخدم هذه البيانات لتجميع جدول مثل الجدول الموضح هنا. يوضح الجدول توزيع المستنسخات التي تم تسلسلها مرتبة حسب عدد الطفرات.

يمكن للمقارنة الإحصائية للقيم المرتبة أن تحدد ما إذا كان أحد التوزيعات يختلف بشكل ملحوظ عن توزيع آخر. ولتسهيل التفسير، يمكن تمثيل البيانات العددية التي تم الحصول عليها من تحليل التسلسل والتحليل الإحصائي إما في شكل مخطط بياني أو مدرج تكراري. وكما هو موضح هنا، ينتج فيروس A 3 72 V طفرات أقل من النوع البري ويظهر تردد طفرات أقل بشكل ملحوظ مع قيمة P أقل من 0.01.

تُعطي نفس المجموعة السكانية من فيروس ganga للدجاج ترددات طفرات مماثلة، سواء تم استخدام المخزون الفيروسي أو تخفيف بمقدار 10^5 لاستخلاص RNA. لذا، وبعد اتباع هذا الإجراء، قد ترغب في إجراء مقايسات كيميائية حيوية في المختبر أو دراسات بلورة لفهم الأساس الآلي والتركيبي للدقة في هذا المتغير من البوليميراز بشكل أفضل.

بعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء لاستكشاف العلاقة بين التنوع الجيني ولياقة الفيروس في الجسم الحي (in vivo). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زيادة فرصك في عزل متغيرات الدقة لفيروسات الـ RNA وكيفية استخدام ترددات الطفرات لتحديد اختلافات الدقة هذه.