إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

أهلاً بكم في مختبر الدكتور Newly John. في فيديو سابق، شرحنا كيفية تصنيع جهاز neuron، وهو منصة تتيح للباحث فصل أجسام الخلايا العصبية عن جزء محوري نقي. وتعد الليثوغرافيا الناعمة هي التقنية المستخدمة لتصنيع هذه الأجهزة، والتي تتكون من صب ومعالجة PDMS فوق رقاقة سيليكون تحتوي على تصميم الجهاز الذي تم تصنيعه مسبقاً باستخدام الليثوغرافيا الضوئية.

في هذا الفيديو، سنقوم بشرح كيفية تحضير العصبونات القشرية للفئران من عمر E 18، وكيفية تحميل هذه العصبونات في جهاز العصبونات. أود أن أقدم لكم كيانا لي، التي ستقوم بإجراء العروض التوضيحية اليوم.

قبل البدء، من المهم تدفئة جميع الأوساط والكواشف الضرورية إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي. يمكنك رؤية وسط neuro basal media و0.25%trypsin وDMEM الذي يحتوي على 10%FBS. ومن المهم التأكد من أن كل ما يتم وضعه في غطاء التدفق الصفائحي لاستخدامه في تحضير الخلايا معقم وممسوح بـ 70%ethanol.

أولاً، يتم مسح غطاء زراعة الأنسجة باستخدام 70% ethanol. بعد ذلك، تُرش الرفوف البلاستيكية المستخدمة لحمل الأنابيب بـ ethanol. ثم يتم تنظيف الكرة المطاطية المستخدمة في عملية التخطيط الثلاثي باستخدام ethanol.

من المهم القيام بذلك في وقت مبكر لضمان توفر الوقت الكافي للجفاف. بعد ذلك، يتم مسح الكواشف اللازمة بالإيثانول ونقلها إلى خزانة سحب الغازات. توضع قطعتان من قشرة دماغ الجنين للجرذ في اليوم 18 (E 18 fetal rat cortex)، تمثلان دماغاً واحداً تم تشريحه مسبقاً، في أنبوب سعة 15 ml يحتوي على 1 ml من محلول بفر التشريح الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم والمبرد بالثلج، ثم يُضاف 1 ml من tripsin EDTA بتركيز 0.25% إلى القشرة الموجودة في محلول بفر التشريح، ليصل الحجم النهائي إلى 2 ml وتركيز trypsin النهائي إلى 0.125%. يُوضع بعد ذلك أنبوب الـ 15 ml الذي يحتوي على القشرة المضاف إليها trypsin في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة ثماني دقائق، بينما تخضع قشرة الجنين للتحضين عند 37 °C في trypsin.

يتم صقل ثلاث ماصات باستج (paste pipettes) بالنار. حيث يوضع طرف الماصة الزجاجية بحيث يلامس اللهب بالقرب من الجزء الأزرق منه، ويتم تدويرها ببطء حتى تتحول الفتحة فقط إلى اللون البرتقالي. وعندما تتحول إلى اللون البرتقالي.

من المهم الاستمرار في تدوير الماصة الزجاجية لمنع انهيارها. لاحظ أن فتحات الماصات الزجاجية تصبح أصغر تدريجياً. ومن المهم أيضاً ملاحظة ضرورة عدم جعل الفتحات صغيرة جداً، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحلل الخلايا بعد تحضين القشرة لمدة ثماني دقائق عند 37 °C مع trypsin. يُضاف 10 ml من DMEM الذي يحتوي على 10% FBS إلى القشرة للمساعدة في إيقاف تفاعل trypsin.

يتم وضع الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على القشرة وDMEM 10%FBS في جهاز الطرد المركزي بسرعة 2,500 RPM لمدة دقيقتين. وفي خزانة السلامة البيولوجية، يُستخدم الشفط بالتفريغ المتصل بماصة زجاجية لإزالة السائل الطافي من القشرة، مع الحرص على عدم تحريك أو إزاحة الراسب.

يُضاف 1 ml من الوسط الأساسي العصبي (neural basal media) المحتوي على B 27 والغلوتامات إلى كتلة القشرة المخية، ثم يتم سحب السائل ودَفعه بلطف باستخدام الماصة. من المهم جداً عدم تكوين فقاعات هوائية أثناء عملية السحب والدفع، حيث يمكن أن تؤدي الفقاعات الهوائية إلى تلف الخلايا عن طريق الأكسدة. بعد ذلك، تُستخدم الماصة الخلفية المصقولة بالنار ذات الفتحة الأوسع لتفتيت القشرة المخية، وذلك عن طريق توصيل بصيلة مطاطية معقمة بنهاية الماصة، ثم السحب والدفع حوالي خمس مرات.

مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هوائية. حسنًا. استمرت العملية مع الماصتين الزجاجيتين الأخريين، حيث تم تصغير فتحة كل منهما. وكما ذُكر سابقًا، من المهم التأكد من عدم إدخال أي فقاعات أثناء عملية التخطيط الثلاثي.

يجب أن تلاحظ أيضاً أنك لم تعد ترى أي كتل مرئية. من المهم الاستمرار في عملية التفتيت حتى لا تعود ترى أي كتل من القشرة في الوسط. بعد ذلك، يتم طرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بسرعة 2,500 RPM لمدة دقيقتين.

هذا هو الحجم التقريبي للراسب المتوقع من قطعتين من القشرة المخية. بعد عملية الطرد المركزي، يتم إزالة السائل الطافي مرة أخرى من راسب الخلايا. وبعد إزالة السائل الطافي، يُضاف 1 ml من الوسط العصبي الأساسي (neuro basal media) الذي يحتوي على B 27 والجلوتامات إلى القشرة المخية ويُستخدم لإعادة تعليق القشرة المخية.

يتم سحب راسب الخلايا بالماصة للأعلى والأسفل مرة أخرى بعناية لتجنب تكون الفقاعات وضمان توزيع راسب الخلايا وتفكيكه بشكل متساوٍ. يُضاف 1 mL إضافي من الوسط الغذائي العصبي الأساسي (neuro basal media) إلى معلق الخلايا ليصل الحجم النهائي إلى 2 mL. بعد ذلك، يتم ترشيح محلول الخلايا المعاد تعليقه عبر مصفاة خلايا من شركة BD biosciences بمسامية 40 micron، وذلك لعد الخلايا وتقييم حيويتها.

يتم وضع 60 µL من وسط عصبي أساسي طازج في أنبوب طرد مركزي صغير معقم. ثم تُضاف 20 µL من الخلايا إلى الـ 60 µL من الوسط العصبي الأساسي، وأخيراً، تُضاف 20 µL من صبغة تريبان الزرقاء (trypan blue) إلى الخلايا الموجودة في الوسط العصبي الأساسي. ستقوم صبغة تريبان الزرقاء بصبغ الخلايا التي لم تعد حية بعد إتمام عملية صبغ الخلايا بالصبغة.

نقوم بنقل 20 µL بواسطة الماصة إلى مقياس كرات الدم ونفحصها تحت المجهر. تظهر الخلايا الحية شفافة ونقية، بينما تكتسي الخلايا التي ثُقبت أغشيتها باللون الأزرق نتيجة صبغة tripan blue. وعادةً ما نحصل على حوالي 2.5 مليون خلية و 8 مليون خلية لكل قشرة مخية.

عادةً ما نحصل على قطعتين من القشرة المخية من دماغ واحد مع إعادة تعليق الخلايا في حجم نهائي قدره 2 mL. وبذلك، يكون التركيز النهائي للخلايا عادةً بين 2.5 million cells per mL و8 million cells per mL. وعادةً ما نقوم بتحميل حوالي 20 µL من الخلايا لكل جهاز.

يمنحنا هذا نطاقاً من الخلايا لكل جهاز يتراوح بين 50,000 خلية و 160,000 خلية. ويمكن تغيير كثافات الخلايا بناءً على التطبيق المستخدم. ومع ذلك، فإن استزراع العصبونات الأولية بكثافة منخفضة جداً يؤدي عادةً إلى موت الخلايا. يتم إحضار الأجهزة التي تم تحضيرها مسبقاً والتي تحتوي على الوسط القاعدي العصبي إلى كبينة السلامة البيولوجية للحفاظ على التعقيم.

يتم إزالة الوسط الزائد من الآبار باستخدام قسم شفط تفريغي. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لعدم إزالة كافة الوسط؛ إذ يجب أن يتبقى بعض الوسط في القناة الرئيسية، ويتم شفط الوسط من الخزانات فقط.

يتم وضع 20 µL فقط من الخلايا في الخزان العلوي الأيسر للجهاز. تتدفق الخلايا إلى داخل الجهاز وتلتصق بالسطح المعالج بـ PLL. هنا يمكنك رؤية الخلايا أثناء تدفقها عبر القناة الرئيسية، وستبدأ في رؤية بعضها قد التصق بالفعل بالزجاج.

بعد التحميل، توضع الأجهزة التي تحتوي على الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق تقريباً للسماح للخلايا بالالتصاق. وبعد مرور 10 دقائق في الحاضنة، تُنقل الأجهزة مرة أخرى إلى كابينة السلامة البيولوجية، وتُملأ الخزانات بالوسط الغذائي، ثم تُعاد الأجهزة إلى الحاضنة. ومن الأمور الهامة التي تجدر الإشارة إليها، أنه بناءً على نوع الحاضنة ومستوى الرطوبة الذي يتطلبه الوسط الغذائي، قد يلزم تغيير الوسط في الأجهزة كل يومين أو ثلاثة أيام.

من الممارسات الجيدة وضع وسط غذائي جديد في الآبار العلوية والسماح بتدفق جزء منه عبر الجهاز وإلى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات. تظهر الخلايا العصبية هنا باستخدام صبغة الكالسيوم، وهي صبغة نفاذة للخلية تصبغ الخلايا الحية. يمكنك هنا رؤية مقصورة S0 أو جانب الخلايا في الجهاز والذي يحتوي على أجسام الخلايا والمحاور والاستطالات الشجرية.

بينما ننتقل عبر الجهاز، يمكنك رؤية الأخاديد الدقيقة التي تنمو من خلالها المحاور العصبية لتصل إلى الجانب الآخر من الجهاز، وهو جانب المحاور، الذي يحتوي على جزء محوري نقي. ولأغراض التوضيح، ستُستخدم هذه الخلايا الموصومة فلورياً لتوضيح إجراء قطع المحور العصبي.

تتمثل إحدى خصائص جهاز neuron في أنه يتيح للباحث إجراء عملية الـ ex otomy، وهي قطع المحاور العصبية من الجزء المحوري النقي في الجهاز، وذلك بهدف إجراء أبحاث مثل دراسة تجدد المحاور العصبية. سيقوم Keano الآن بتوضيح كيفية إجراء عملية الـ ex otomy في جهاز neuron، حيث يتم تنفيذ هذه العملية باستخدام جهاز شفط.

توضع ماصة زجاجية معقمة عند الفتحة السفلية للبئر من جهة المحور العصبي، ويُشفط الوسط باستخدام المكنسة الكهربائية (Vacuum). يتم إزالة كافة الأوساط تماماً من جهة المحور العصبي للجهاز، بما في ذلك الوسط الموجود في القناة الرئيسية. ولتكرار هذه العملية بعد إزالة الوسط، يتم دفع 150 µL من الوسط إلى القناة الرئيسية عن طريق وضع طرف الماصة عند فتحة القناة الرئيسية والضغط على الماصة بقوة.

بعد ذلك، يتم تطبيق تفريغ هوائي على فتحة القناة الرئيسية والبئر العلوي في الجانب المحوري للجهاز. يُستخدم التفريغ الهوائي مرة أخرى لإزالة جميع الأوساط من الجانب المحوري، بما في ذلك القناة الرئيسية. ومجدداً، يتم دفع 150 µL من الوسط إلى داخل القناة الرئيسية عن طريق وضع طرف الماصة عند فتحة القناة الرئيسية والضغط على الماصة بقوة.

عند هذه النقطة، يمكن للباحث فحص الجهاز تحت المجهر للتحقق من كفاءة قطع المحاور العصبية. وإذا لم يتم قطع المحاور بشكل كافٍ، يمكن تكرار العملية مرة أخرى حسب الضرورة. لقد عرضنا لكم في هذا الفيديو كيفية تحضير عصبونات قشرية جنينية من الفئران في اليوم 18 (E 18) وتحميلها في جهاز العصبونات.

تتمثل الميزة الأساسية لهذه الأجهزة في القدرة على فصل وتقسيم استزراع أجسام الخلايا العصبونية على أحد جانبي الجهاز عن جزء محوري نقي على الجانب الآخر من الجهاز. نأمل أن يكون هذا الفيديو مفيداً ونافعاً لكم. هذا كل ما لدينا من مختبر جون.

شكراً للمشاهدة.