إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

مرحبا ومرحبا بكم في مختبر الدكتور نيو جون. في مقطع فيديو سابق ، أوضحنا كيف نصنع جهاز الخلايا العصبية ، وهو نظام أساسي يسمح للباحث بفصل أجسام الخلايا العصبية عن جزء محوري نقي. الطباعة الحجرية الناعمة هي التقنية المستخدمة في صنع الأجهزة ، والتي تتكون من صب ومعالجة PDMS على رقاقة سيليكون تحتوي على تصميم الجهاز الذي تم تصنيعه مسبقا باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية.

في هذا الفيديو، سنوضح تحضير الخلايا العصبية القشرية للفئران spro dolly E 18، وكيفية تحميل الخلايا العصبية في الجهاز العصبي. أود أن أقدم لكم كيانا لي. ستقوم بالمظاهرات اليوم.

قبل البدء ، من المهم أن يكون لديك جميع الوسائط والكواشف اللازمة دافئة إلى 37 درجة في الحمام المائي. يمكنك رؤية الوسائط القاعدية العصبية 0.25٪ التريبسين و DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS. من المهم التأكد من تعقيم كل شيء يتم وضعه في غطاء المحرك لاستخدامه في إصلاح الخلايا ومسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول.

أولا ، يتم مسح غطاء مزرعة الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، يتم رش الرفوف البلاستيكية المستخدمة لتثبيت الأنابيب بالإيثانول. بعد ذلك ، يتم تنظيف الكرة المطاطية المستخدمة في عملية التصفيف الثلاثي بالإيثانول.

من المهم القيام بذلك في وقت مبكر حتى يكون لديه وقت كاف ليجف. بعد ذلك ، يتم مسح الكواشف اللازمة بالإيثانول والانتقال إلى غطاء المحرك. يتم وضع قطعتين من قشرة الفئران الجنينية E 18 التي تمثل دماغا واحدا تم تشريحه مسبقا في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على مل واحد ، مثلج بارد ، خالي من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم ، يضاف مل واحد من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى القشرة في المخزن المؤقت للتشريح ، مما يجعل الحجم النهائي إلى مطحنتين وتركيز التجربة النهائي إلى 0.125٪ ثم يتم وضع الأنبوب سعة 15 مل الذي يحتوي على القشرة مع إضافة التربسين الآن في حمام مائي بزاوية 37 درجة لمدة ثماني دقائق ، بينما تحتضن قشرة الجنين عند 37 درجة في التربسين.

ثلاث ماصات معجون مصقولة بالنار. يتم وضع طرف الماصة الزجاجية على اتصال مع اللهب بالقرب من الجزء الأزرق من اللهب ، ويتم تدويره ببطء حتى تتحول الفتحة إلى اللون البرتقالي. كما تحولت إلى اللون البرتقالي.

من المهم الاستمرار في تدوير الماصة الزجاجية حتى لا تنهار. لاحظ أن فتحات الماصات الزجاجية أصغر على التوالي. من المهم أيضا ملاحظة أنك لا تريد أن تجعل الفتحات صغيرة جدا لأن هذا يمكن أن يتسبب في تحلل الخلايا بعد تحضين القشرة لمدة ثماني دقائق عند 37 درجة مع إضافة 10 مل من DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS إلى القشرة للمساعدة في إيقاف تفاعل التربسين.

أنبوب 15 مل الذي يحتوي على القشرة و DMEM 10٪ FBS عبارة عن جهاز طرد مركزي عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. في خزانة السلامة الحيوية ، يتم استخدام شفط الفراغ المتصل بماصة زجاجية لإزالة المادة الطافية من القشرة. الحرص على عدم إزعاج الحبيبات أو إزااحتها.

مل واحد من الوسائط القاعدية العصبية التي تحتوي على B 27 والغلوتامات إلى حبيبات القشرة ويتم ماصتها برفق لأعلى ولأسفل. من المهم جدا عدم إنشاء فقاعات هواء أثناء سحب العينات لأعلى ولأسفل لأن فقاعات الهواء يمكن أن تلحق الضرر بالخلايا عن طريق الأكسدة. بعد ذلك ، قامت الماصة الخلفية المصقولة بالنار بأوسع فتحة كما هو مستخدم لتصريف القشرة عن طريق ربط لمبة مطاطية معقمة بنهاية الماصة وسحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات تقريبا.

الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء. حسنًا. استمرت العملية مع الماصتين الزجاجيتين الأخريين مع انخفاض حجم الفتحة. كما ذكرنا سابقا ، من المهم التأكد من عدم إدخال أي فقاعات أثناء عملية الخطوط الثلاثية.

يجب أن تلاحظ أيضا أنك لم تعد ترى أي أجزاء مرئية. من المهم الحفاظ على تصنيف ثلاثي حتى لا تتمكن من رؤية أي من أجزاء القشرة في الوسائط. بعد التشكيل ، يتم دمج الخلايا مرة أخرى عند 2 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.

هذا هو الحجم التقريبي للحبيبات التي يتوقعها المرء من قطعتين من القشرة. بعد الطرد المركزي ، تتم إزالة sup natin مرة أخرى من حبيبات الخلية. بعد إزالة سوبر ناتين ، يضاف مل واحد من الوسائط القاعدية العصبية التي تحتوي على B 27 والغلوتامات إلى القشرة وتستخدم لتعليق القشرة.

يتم سحب حبيبات الخلية مرة أخرى لأعلى ولأسفل بعناية لتجنب إضافة الفقاعات والتأكد من توزيع حبيبات الخلية وتفكيكها بالتساوي. تتم إضافة ميل آخر من الوسائط القاعدية العصبية إلى تعليق الخلية ، مما يجعل الحجم النهائي يصل إلى مللين. بعد ذلك ، يتم ترشيح محلول الخلية المعلق من خلال مصفاة خلايا BD Biosciences 40 ميكرون بجوار عد الخلايا وتقييم الجدوى.

يتم وضع 60 ميكرولترا من الوسائط القاعدية العصبية الطازجة في أنبوب فوج دقيق معقم. ثم تضاف 20 ميكرولترا من الخلايا إلى 60 ميكرولترا من الوسائط القاعدية العصبية ، وأخيرا ، يضاف 20 ميكرولترا من اللون الأزرق إلى الخلايا الموجودة في الوسط القاعدي العصبي. سوف يلطخ اللون الأزرق الثلاثي الخلايا التي لم تعد حية بعد تلطيخ الخلايا باللون الأزرق التريان.

20 ميكرولترا على مقياس الخلوي الدموي ونعرضها تحت المجهر. تبدو الخلايا القابلة للحياة واضحة وشفافة بينما تظهر الخلايا التي ثقبت أغشيتها باللون الأزرق بسبب اللون الأزرق الثلاثي. عادة ، نحصل على حوالي 2.5 مليون خلية و 8 ملايين خلية لكل قشرة.

عادة ما نحصل على قطعتين من القشرة من دماغ واحد مع إعادة تعليق الخلايا في حجم نهائي من ملين. وبالتالي ، فإن التركيز النهائي للخلايا يتراوح عادة بين 2.5 مليون خلية لكل مل و 8 ملايين خلية لكل مل. عادة ، نقوم بتحميل حوالي 20 ميكرولتر من الخلايا لكل جهاز.

هذا يعطينا مجموعة من الخلايا لكل جهاز بين 50،000 خلية و 160،000 خلية. يمكن أن تختلف كثافة الخلايا حسب التطبيق. ومع ذلك ، فإن بذر الخلايا العصبية الأولية بكثافة منخفضة جدا يؤدي عادة إلى موت الخلايا يتم إحضار الأجهزة المعدة مسبقا التي تحتوي على وسائط قاعدية عصبية إلى خزانة السلامة الحيوية للحفاظ على العقم.

تتم إزالة الوسائط الزائدة من الآبار بواسطة قسم مفرغ. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم إزالة جميع الوسائط. يجب أن يكون هناك بعض الوسائط في القناة الرئيسية فقط لسحب الوسائط من الخزانات.

يتم تطبيق 20 ميكرولترا فقط من الخلايا على الخزان العلوي الأيسر للجهاز. تتدفق الخلايا إلى الجهاز وتتعلق على السطح المعالج ب PLL. هنا يمكنك رؤية الخلايا وهي تتدفق عبر القناة الرئيسية ، وستبدأ في رؤية بعضها متصلة بالفعل بالزجاج.

بعد التحميل ، يتم وضع الأجهزة التي تحتوي على الخلايا مرة أخرى في حاضنة لمدة 10 دقائق تقريبا للسماح للخلايا بالاتصال. بعد 10 دقائق في الحاضنة ، يتم إحضار الأجهزة مرة أخرى إلى خزانة السلامة الحيوية ، وتمتلئ الخزانات بالوسائط ثم يتم وضع الأجهزة مرة أخرى في الحاضنة. قد تحتاج بعض الأشياء المهمة الجديرة بالملاحظة ، اعتمادا على الحاضنة ومستوى الرطوبة التي تحتاجها الوسائط ، إلى التغيير في الأجهزة كل يومين إلى ثلاثة أيام.

من الممارسات الجيدة وضع وسائط جديدة في الآبار العلوية والسماح لبعض الوسائط الجديدة بالتدفق عبر الجهاز وإلى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات. يتم تصور الخلايا العصبية هنا بالكالسيوم ، وهي صبغة دائمة للخلية تلطخ الخلايا الحية. هنا يمكنك رؤية جانب الحجرة أو الخلية للجهاز الذي يحتوي على أجسام الخلايا والمحاور والتشعبات.

أثناء تحريكنا عبر الجهاز ، يمكنك رؤية الأخاديد الدقيقة التي تنمو من خلالها المحاور للوصول إلى الجانب الآخر من الجهاز ، الجانب المحوري ، الذي يحتوي على جزء محوري نقي. لأغراض العرض التوضيحي. سيتم استخدام هذه الخلايا المصنفة بالفلورسنت لتوضيح إجراء استئصال الأذن بالفأس.

تتمثل إحدى خصائص جهاز الخلايا العصبية في أنه يسمح للباحث بإجراء استئصال الأذن خارج وهو قطع المحاور من الجزء المحوري النقي للجهاز. من أجل إجراء البحوث مثل دراسة التجديد المحوري. سيظهر كيانو الآن أداء استئصال الأذن السابقة في جهاز الخلايا العصبية ، ويتم إجراء استئصال الأذن السابق بواسطة فراغ.

يتم وضع ماصة زجاجية معقمة في الفتحة السفلية للبئر على الجانب المحوري ، ويتم شفط الوسائط عن طريق الفراغ. تتم إزالة جميع الوسائط تماما من الجانب المحوري للجهاز ، بما في ذلك الوسائط الموجودة في القناة الرئيسية. لتكرار العملية بعد إزالة الوسائط ، يتم دفع 150 ميكرولترا من الوسائط إلى القناة الرئيسية عن طريق وضع طرف الماصة عند فتحة القناة الرئيسية والضغط على الماصة بقوة.

بعد ذلك ، يتم تطبيق الفراغ على فتح القناة الرئيسية والبئر العلوي للجانب المحوري للجهاز. يتم استخدام الفراغ مرة أخرى لإزالة جميع الوسائط من الجانب المحوري ، بما في ذلك القناة الرئيسية. مرة أخرى ، يتم دفع 150 ميكرولترا من الوسائط إلى القناة الرئيسية عن طريق وضع طرف الماصة عند فتحة القناة الرئيسية والضغط على الماصة بقوة.

في هذه المرحلة ، يمكن للباحث عرض الجهاز تحت المجهر للتحقق من كفاءة قطع المحور العصبي. إذا لم يتم قطع المحاور بشكل كاف ، فيمكن تكرار العملية مرة أخرى حسب الضرورة. في هذا الفيديو ، أوضحنا لك كيفية تحضير الخلايا العصبية القشرية لرف الجنين E 18 وتحميلها في جهاز الخلايا العصبية.

الميزة الأساسية لهذه الأجهزة هي القدرة على فصل وتجزئة ثقافة أجسام الخلايا العصبية على جانب واحد من الجهاز من جزء محوري نقي على الجانب الآخر من الجهاز. نأمل أن تكون قد وجدت هذا الفيديو مفيدا ومفيدا. هذا كل شيء من مختبر جون.

شكرا للمشاهدة.