تحديد المجموعات الفرعية للخلايا التائية التنظيمية من الغدد الليمفاوية لتصريف البنكرياس في الفئران

الخلايا التائية التنظيمية ، أو Tregs ، هي مجموعة سكانية فرعية متخصصة في الخلايا التائية تمارس تأثيرات مثبطة للمناعة للتوسط في توازن الجهاز المناعي. تعبر Tregs عن علامات سطح الخلية CD4 و CD25 و Neuropilin 1 و Nrp1 وعوامل النسخ النووي صندوق شوكة P3 و Foxp3 و Helios.

لعزل Tregs من الغدد الليمفاوية لتصريف البنكرياس للفأر ، أو PDLNs ، ضع شبكة معدنية فوق أنبوب مخروطي الشكل. ضع PDLNs على الشبكة وطحن الأنسجة لفصلها ميكانيكيا. أضف وسيطا مناسبا فوق الشبكة ، وقم بغسل الخلايا في الأنبوب.

أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة الخلايا الميتة والحطام الخلوي. أعد تعليق الخلايا القابلة للحياة في الوسائط. مرر الخلايا من خلال غطاء مصفاة خلية مثبت على أنبوب دائري القاع للحصول على تعليق متجانس أحادي الخلية ، مما يقضي على أي كتل خلية متبقية.

أضف الأجسام المضادة المضادة ل CD4 المترافقة بالفلوروكروم ، والأجسام المضادة ل CD25 ، والمضادة ل Nrp1. ترتبط الأجسام المضادة المضادة ل CD4 و CD25 بمستضدات سطح الخلية الخاصة بها في Tregs. في الوقت نفسه ، يرتبط anti-Nrp1 بمستقبلات Nrp1.

عالج الخلايا بمخزن مؤقت مناسب لتثبيت النفاذية ، وإصلاح الخلايا واختراق الأغشية الخلوية والنووية. أضف الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم التي تستهدف Foxp3 و Helios.

تسمح الأغشية المنفذة للأجسام المضادة بدخول الخلايا والارتباط بأهدافها داخل النواة. تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.

تتميز Tregs بالتعبير الإيجابي عن سطح الخلية ل CD4 و CD25 و Nrp1 ، جنبا إلى جنب مع عوامل النسخ النووي Foxp3 و Helios.

أولا ، ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مليلتر في الرف. ضع شبكة معدنية معقمة 250 ميكرومتر فوق الأنبوب. اشطف الشبكة ب 1 ملليلتر من RPMI. بعد ذلك ، انقل الغدد الليمفاوية إلى الشبكة المعدنية ، واستخدم زوجا من الملقط لطحنها من خلال الشبكة. ضع 1 مليلتر من RPMI على الشبكة لطرد الخلايا في الأنبوب. كرر عملية نقل وطحن الغدد الليمفاوية ثلاث مرات لكل عينة ، ثم قم بإزالة الشبكة.

الطرد المركزي للأنابيب عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في حوالي 5 ملليلتر من RPMI ، ثم املأ الأنابيب ب RPMI. كرر هذه العملية من الطرد المركزي للعينات إلى ملء الأنبوب ب RPMI مرة واحدة.

بالطرد المركزي للأنابيب مرة أخرى عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من RPMI. انقل 2 مل من تعليق الخلية إلى أنابيب مستديرة القاع سعة 5 ملليلتر مع أغطية مصفاة خلية.

أولا ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من عينات PDLN عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية. قم بتلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة السطحية ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 40 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه العملية - إضافة المخزن المؤقت ، والطرد المركزي ، والتخلص من المادة الطافية مرة واحدة. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من مخزن التثبيت النفاذية لإصلاح الخلايا ونفاذها.

انقل الأنابيب إلى الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية من عينات PDLN عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من مخزن غسيل النفاذية. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.

تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة داخل الخلايا ، كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن غسيل النفاذية إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 433 × جم وعند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول غسيل النفاذية.

جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 433 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في بروتوكول النص.