الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام مقايسة تثبيط بشرية في المختبر لقياس وظيفة الخلايا التائية التنظيمية (treg) والتنبؤ باحتمالية فقدان وظيفتها مستقبلاً. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير واختبار خرزات مرمزة، والتي ستُستخدم كمحفزات خلوية. وتتمثل الخطوة الثانية في عزل خلايا تائية ساذجة نقية موجبة لـ CD4 وسالبة لـ CD25، وخلايا تائية منشطة في الجسم موجبة لـ CD4 ومنخفضة التعبير عن CD25، وخلايا تائية تنظيمية موجبة لـ CD4 وعالية التعبير عن CD25، بالإضافة إلى خلايا أحادية نووية من نخاع العظم (BMCs) من الفص الذي تم تشعيعه لاستخدامها كخلايا مقدمة للمستضد (APCs).

بعد ذلك، يتم إعداد مزارع أحادية من الخلايا التائية الساذجة أو المنشطة كخلايا مستجيبة مع خلايا P BMCs كخلايا عارضة للمستضد (APCs)، أو مزارع مشتركة تحت نفس الظروف، ولكن مع إضافة الخلايا التائية التنظيمية (tregs) بنسبة 1 إلى 10. وتتمثل الخطوة النهائية في حصاد الخلايا وقياس تكاثرها عن طريق دمج الثيميدين المسمى بالتريتيوم. وفي النهاية، يمكن أن توضح النتائج التي تم الحصول عليها الفروقات في تثبيط استجابات الخلايا التائية الساذجة مقابل تلك المنشطة داخل الجسم الحي.

اسمي جيف وودكليف. لا تعبر الخلايا التائية التنظيمية عن علامات فريدة على سطح الخلية، لذا، ومن أجل قياس وظيفتها بشكل موثوق، يجب عزلها باستخدام تقنيات توفر أفضل فصل ممكن.

تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة مقارنة بالطرق الأخرى مثل العزل الأقصى، في أن تقنية fax توفر مجموعات خلوية نقية للغاية. ومن ثم، يمكن اختبار وظيفة الخلايا بشكل موثوق في مقايسات التثبيط في المختبر (in vitro) كما هو موضح هنا. ومع أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة خلايا treg لدى الأشخاص الأصحاء والمصابين بمرض السكري من النوع الأول، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أمراض مناعية ذاتية أخرى مثل التهاب المفاصل الروماتويدي البشري، والذئبة الحمراء الجهازية، والتصلب المتعدد، وغيرها. لطلاء حبيبات taal المنشطة بمضاد CD three البشري.

أضف 1 mL من حبيبات M four 50 toil المنشطة من القارورة الأصلية إلى أنبوب سعة 1.5 mL، وضع الأنبوب في حامل مغناطيسي حتى تلتصق جميع الحبيبات بجدار الأنبوب. ثم قم بإزالة منظم الحبيبات عن طريق سحبه بالماصة بينما لا يزال الأنبوب في الحامل المغناطيسي. بعد ذلك، أخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 1 mL من المنظم 1.

ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي مراراً وتكراراً. قم بإزالة المحلول المنظم بينما لا يزال الأنبوب في الحامل المغناطيسي. أعد تعليق الحبيبات في 1 mL من المحلول المنظم 1 مرة أخرى.

في هذه الخطوة، يتم إضافة 40 µL من anti-human CD3 أيضاً. تُرج الخرزات مع الجسم المضاد عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يُضاف 0.1% w/v BSA، ويستمر الرج لمدة 16 ساعة تالية.

بعد ذلك، اغسل الخرزات مرتين باستخدام المنظم الثاني عن طريق تحضين الخرزات في 1 mL من المنظم الثاني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة تتراوح بين 2 إلى 8 °C، ثم قم بإزالة المنظم أثناء وضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي. ثم اغسل الخرزات مرة أخرى تحت نفس الظروف المعقمة.

باستخدام 1 mL من المنظم 3 هذه المرة، اختبر كفاءة طلاء الأجسام المضادة عن طريق إضافة عدد متغير من الخرزات المطلية بـ CD3 لكل خلية من أجل تحديد النسبة المثلى، مع وضع 50,000 من خلايا PBMC في كل بئر بثلاث مكررات في طبق 96 بئراً. بعد 72 ساعة من الزرع عند 37 °C، أضف 1 µCi من الثيميدين المـُوسوم بالتريتيوم واستمر في التحضين لمدة 16 ساعة تالية. احصد الخلايا في طبق حصاد متعدد الشاشات أو ما يماثله.

أضف سائل الوميض واقرأ عدد النبضات في الدقيقة أو CPM لكل بئر. باستخدام عداد وميضي من طراز top count N XT، أو ما يشابهه، حدد نسبة الخرزات إلى الخلايا باستخدام النسبة التي تعطي CPM أعلى من 5,000 باستمرار، ولكن أقل من 15,000 بناءً على خبرتنا. وعادةً ما تعطي نسبة ثلاث خرزات لكل خلية التحفيز الأمثل لكل من الخلايا المستجيبة وخلايا treg في جميع الأشخاص البشر الذين تم اختبارهم.

املأ أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter بـ 15 milliliters من fal plus. ثم قم بإجراء تخفيف بنسبة 1 إلى 6 لـ 50 milliliters من الطبقة الميضية (buffy coat) عن طريق إضافة 250 milliliters من PBS إلى أنبوب الدم. أضف 25 milliliters من الطبقة الميضية المخففة ببطء فوق fial pack مع الحرص على عدم تعكير الطبقات.

قم بإجراء الطرد المركزي عند 800 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. مع إيقاف تشغيل المكابح، اجمع بعناية طبقة PBMC، وهي المرحلة المتوسطة البيضاء الموجودة بين fial والمحلول المنظم. إذا لزم الأمر، قم بكشط الخلايا من جدار الأنبوب.

انتظر لبضع دقائق وقم بجمعهما من الطور المتوسط مرة أخرى. انقل الخلايا إلى أنابيب سعة 50 milliliter جديدة واغسلها بملء الأنابيب بـ PBS pellet. الـ PBM cs.

كرر خطوة الغسل مرتين في كل مرة. ادمج كل راسبين من الخلايا في أنبوب واحد، وفي النهاية ادمج جميع رسايب الخلايا في أنبوب واحد سعة 50 milliliter. بعد ذلك، استخدم 20 microliters من الخلايا المعلقة لتحديد حيوية الخلايا عن طريق استبعاد trian blue.

قم بتوليد خلايا مقدمة للمستضد (APCs) التجريبية عن طريق نقل 1 mL من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (pbmc) الحيوية إلى أنبوب جديد. ثم أضف 4 mL من الوسط الغذائي وعرّض الخلايا للإشعاع بجرعة 5,000 rads، ثم املأ الأنبوب الذي يحتوي على بقية خلايا P BMCs حتى الحافة باستخدام محلول PBS المنظم. بعد ذلك، قم بتدوير الخلايا بجهاز الطرد المركزي بسرعة 250 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم اسكب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 4 mL من المزيج نفسه.

ثم أضف 200 µL من الخرزات الدقيقة anti CD4 إلى خلايا pbmc واحضن خليط الخلايا والخرزات عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. بعد الحضن، اغسل الخلايا في 40 mL من محلول PBS المنظم، ثم قم بترسيب الخلايا. بعد ذلك، صب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 8 mL من محلول Degas PBS المنظم في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، استخدم مرشحات فصل مسبقة لفصل معلق الخلايا. ثم قسم معلق الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBM CS) إلى أنبوبين سعة 15 milliliter. مع إضافة أربعة milliliters من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (P BMCs) إلى كل أنبوب.

قم بتثبيت عمودين بشكل محكم في فاصل ميني مكس (minimax separator)، وضع أنابيب تجميع أسفل كل عمود. بعد ذلك، أضف 3 mL من منظم DGAs PBS إلى كل عمود؛ وعندما ينفد المنظم، ضع محلول الخلايا بالكامل بحجم 4 mL من كل أنبوب فوق الأعمدة قبل أن ينفد معلق الخلايا تماماً. أضف 3 mL من منظم DGAs PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى كل عمود، واترك المنظم يتدفق عبر الأعمدة وصولاً إلى أنابيب التجميع.

أضف المزيد من المحلول المنظم حتى يخرج صافياً. قم بنقل 5 مل إضافية من محلول DGAs المنظم إلى أعمدة LS، ثم قم بإزالة أعمدة LS من الفاصل minimax. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع جديدة معقمة سعة 50 مل.

اترك نصف مللي لتر يتدفق للخارج، ثم ادفع بقية الحجم ببطء، وهو ما يعادل أربعة مللي لترات تقريباً. الآن، ادمج الكسرين الإيجابيين لـ CD4. بعد ذلك، أضف ما يصل إلى 50 مللي لتر من PBS إلى الأنبوب، وقم بعدّ الخلايا بعد طردها مركزياً عند 400 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

أعد تعليق الخلايا في 2 mL من محلول PBS المنظم. اخلط الأجسام المضادة التي ستُستخدم في صبغ الـ fact في أنبوب واحد: anti CD 14 وCD 32 وCD one 16، وبشكل اختياري anti CD four. خذ عينة من المزيج لصبغ أنبوب FLUOROCHROME minus one.

قم بتحضير أنبوب FMO عن طريق نقل 5 µL من معلق الخلايا (بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر) إلى أنبوب fax، ثم قم بصبغ الخلايا باستخدام 2 µL من كوكتيل الأجسام المضادة المُحضّر مسبقاً. بعد ذلك، أضف خلايا غير مصبوغة وحبيبات مغطاة بـ mouse IgG ليتم صبغها بفلوروكروم واحد في أنابيب fax فردية جديدة لاستخدامها كضوابط تعويض (compensation controls) لفرز الخلايا. ثم أضف 50 µL من anti-human CD 25 PE إلى الكوكتيل، وأضف الكوكتيل إلى بقية معلق الخلايا.

قم بتحضين الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة. بعد تحضين الخلايا مع مزيج الأجسام المضادة، أضف منظم PBS إلى الخلايا ثم قم بترسيبها. قم بإعادة تعليق الراسب في منظم PBS بتركيز 10⁷ خلية/ملل.

استخدم أنبوب FMO لتحديد عتبة فرز الخلايا التائية الموجبة لـ CD 25. وباستخدام استراتيجية البوابة هذه، قم أولاً بوضع بوابة حول الخلايا السالبة لـ FITC لاستبعاد الخلايا الموجبة لـ FITC، والتي تشمل الخلايا الوحيدة، والبلاعم، وجميع الخلايا الأخرى الموجبة لـ CD 4 غير التائية كما هو موضح في هذا الشكل. وفي مخطط منفصل، ارسم بوابات للخلايا التائية السالبة لـ CD 25، والخلايا التائية ذات التعبير المنخفض عن CD 25، وخلايا treg ذات التعبير العالي عن CD 25 كما في هذا الشكل.

بعد عملية التدفق وفرز المجموعات الخلوية، قم بترسيب الخلايا في أنابيب الجمع ثم احتفظ بالخلايا التائية (T-cell) على الثلج حتى مرحلة الزرع. قم بتسمية طبق 96 بئر بقاع على شكل حرف U كما هو موضح في الجدول. قم بتعليق مقدار 50 µL من الخرز المغلف بـ CD3، محسوباً بتركيز ثلاث خرزات لكل خلية مستجيبة في كل بئر، في وسط غذائي كامل يحتوي على 10% من مصل AB البشري المجمع في طبق 96 بئر، ثم قم بتخفيف الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) المشععة سابقاً في الوسط الغذائي إلى تركيز 5 × 10⁵ خلايا/mL.

أضف 50 µL من الخلايا إلى طبق بـ 96 بئراً، ثم أضف 2.5 × 10⁴ من الخلايا التائية CD4+ CD25- أو CD4+ CD25 low لكل بئر في ثلاث مكررات. أضف خلايا Tregs إلى الصف B وإلى الآبار المحددة كـ Tregs only من المزرعة المشتركة بنسبة 1:10 كما هو موضح هنا. بعد ذلك، حضن الطبق عند 37 °C في حضانة تحتوي على 5% CO2 ورطوبة مشبعة لمدة 72 ساعة. تالياً، قم بنبض الخلايا بـ 1 µCi من tritiated thymidine، ثم استمر في التحضين عند 37 °C لمدة 16 ساعة التالية بعد دمج thymidine في الساعات القليلة الأخيرة من المزرعة المشتركة.

استخدم جهاز حصاد Filter mate لحصاد الخلايا على لوحة حصاد متعددة الشاشات. ثم غطِّ لوحة الحصاد بغطاء بلاستيكي شفاف مملوء مسبقاً بسائل وميضي. وأخيراً، اقرأ قيمة CPM لكل بئر.

باستخدام عداد وميضي، يمكن عزل المجموعات الفرعية للخلايا التائية بنقاوة عالية بواسطة هذا النظام، كما يظهر في سلسلة مخططات النقاط التالية؛ حيث تظهر هنا الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 والسالبة لـ CD25 في البوابة السفلية. وفي الشكل التالي، يمكن رؤية خلايا تائية عالية النقاوة موجبة لـ CD4 ومنخفضة التعبير عن CD25. هذه مجموعة نقية من الخلايا الموجبة لـ CD4 التي تم فرزها بالتدفق الخلوي.

تظهر خلايا treg ذات التعبير العالي لـ CD 25 في التحكم بالبوابة العلوية. أظهرت مستنبتات الخلايا المفردة من APCs وtregs من أشخاص أصحاء تكاثراً ضئيلاً أو معدوماً فوق مستوى الخلفية وفقاً لقياس دمج الثيميدين، بينما أظهرت خلايا T الساذجة السلبية لـ CD 25 وخلايا T المنشطة في الجسم الحي وذات التعبير المنخفض لـ CD 25 تكاثراً ملحوظاً يتم تثبيطه عندما يتم استزراع هذه الأنواع من الخلايا المستجيبة مع خلايا treg. وعلى الرغم من ذلك، لوحظت اختلافات طفيفة في قدرة tregs على تثبيط خلايا T الساذجة السلبية لـ CD 25 وخلايا T المنشطة في الجسم الحي وذات التعبير المنخفض لـ CD 25 المستجيبة.

لم تكن هذه مجموعة ضابطة ذات دلالة إحصائية. أظهرت المزارع أحادية الخلية للخلايا المقدمة للمستضد (APCs) والخلايا التائية المنظمة (Tregs) المأخوذة من الأشخاص المعرضين للخطر تكاثراً ضئيلاً أو معدوماً مقارنة بالمستوى الخلفي، وذلك وفقاً لقياس دمج الثيميدين. بينما أظهرت الخلايا التائية الساذجة السالبة لـ CD 25 والخلايا التائية المنشطة حيوياً (InVivo) ذات المستوى المنخفض من CD 25 مستويات تكاثر أقل مقارنة بالمجموعات الضابطة السليمة.

تم تثبيط الخلايا التائية المستجيبة بشكل أكبر بواسطة الخلايا التائية التنظيمية (tregs) والمستنبتات المشتركة، حيث قدم الفحص نتائج موثوقة. ويمكننا استنتاج أن قيم CPM المنخفضة تشير إلى عيوب محتملة في نقل الإشارة، وهو ما ينبغي استقصاؤه بشكل أكبر في نوع مختلف من الدراسات. ومع ذلك، كان الفرق في قدرة الخلايا التائية التنظيمية على تثبيط الخلايا التائية المستجيبة سالبة CD 25 مقابل تلك ذات التعبير المنخفض عن CD 25 في الأشخاص المعرضين للخطر فارقاً جوهرياً.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الربط السلس بين جميع الخطوات الضرورية لإجراء اختبار وظيفي ناجح وموثوق للكشف عن وجود Tregs لدى الأشخاص الأصحاء والأشخاص الذين يعانون من ضعف في جهاز المناعة، كما هو الحال على سبيل المثال لدى المصابين بمرض السكري من النوع الأول.