تحريض التهاب الأمعاء والقولون الناخر في نموذج الأمعاء الظهارية البشري

احصل على الخبايا المشتقة من أنسجة الأمعاء الدقيقة البشرية — الغزوات الأنبوبية التي تحتوي على الخلايا الجذعية وأنواع مختلفة من الخلايا الظهارية.

أضف الخبايا المعوية إلى مصفوفة الطابق السفلي المبردة.

انقل هذا الخليط إلى صفيحة متعددة الآبار ، مما يخلق قبة ثلاثية الأبعاد.

أضف وسط النمو واحتضن.

تنظم الخلايا الجذعية ذاتيا وتتكاثر وتتمايز إلى أنواع متعددة من الخلايا المعوية ، وتشكل الغلاف المعوي.

بمرور الوقت ، تنضج الأمعاء إلى الأمعاء - هياكل ثلاثية الأبعاد ذاتية التجديد ، تشبه الخبايا المعوية.

أضف عديدات السكاريد الدهنية ، أو LPS ، وهو سم داخلي بكتيري ، إلى البئر المحتوي على الأمعاء واحتضنها.

ترتبط جزيئات LPS بالمستقبلات الشبيهة بالحصيلة في الأمعاء ، مما يؤدي إلى استجابة مؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية. يؤدي هذا إلى سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج.

وبالتالي ، تتعرض سلامة الأمعاء للخطر ، مما يؤدي إلى تغلغل LPS في التجويف ، مما يزيد من تكثيف الاستجابة الالتهابية.

هذا يحاكي تطور التهاب الأمعاء والقولون الناخر ، وهو التهاب حاد في أمعاء الأطفال الخدج.

في وقت التجميع في جناح العمليات ، ضع عينة الأنسجة المعوية الدقيقة البشرية في DPBS الباردة. اغسل العينة في DPBS البارد حتى تصبح خالية من الدم والبراز.

قم بتخزين العينة في وسط RPMI 1640 عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لعزل القبوة. عندما تكون جاهزا للمتابعة ، تحقق مرة أخرى للتأكد من أن العينة خالية من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بإزالة أي دهون زائدة أو مشابك جراحية ودبابيس. قم بوزن العينة ، واستهدف قطعة يتراوح وزنها بين 0.75 و 2.5 جرام.

بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع بحجم 0.5 سم ، وضعها في أنبوب يحتوي على 30 مل من المخزن المؤقت المخلب # 1. رج العبوة على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتصفية الأنسجة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، وتخلص من التدفق.

أضف الأنسجة المفلترة إلى أنبوب يحتوي على 30 مل من المخزن المؤقت المخلب # 2. رج العبوة على سرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بتصفية الأنسجة من خلال مرشح 100 ميكرومتر ، وتخلص من التدفق.

بعد ذلك ، قم بإذابة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لاستخدامها لاحقا. أضف بعض الأنسجة إلى 10 ملليلتر من DMEM البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، ورجها بقوة باليد لمدة 10 ثوان. قم بتصفية هذا التعليق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، واجمع التدفق. احتفظ بهذا الأنبوب على الجليد.

أضف بعض الأنسجة إلى 10 ملليلتر أخرى من DMEM البارد في أنبوب مخروطي منفصل سعة 50 ملليلتر ، ورجها بقوة باليد لمدة 10 ثوان. قم بتصفية هذا التعليق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر ، واجمع التدفق.

كرر هذه العملية مرتين إضافيتين حتى يكون هناك أربعة أنابيب مخروطية تحتوي على تدفق من واحد إلى أربعة. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول في الأنبوب رقم واحد من خلال مصفاة خلوية 100 ميكرومتر ، وانقل التدفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يسمى أيضا رقم واحد. كرر هذه العملية للأنابيب من اثنين إلى أربعة.

الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر عند 200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة المادة الطافية من كل أنبوب وتخلص منها. تجنب تعطيل سحابة الأنسجة فوق الحبيبات مباشرة ، حتى لو كان ذلك يعني ترك بعض المواد الطافية وراءها. في كل أنبوب ، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل ببطء لخلط الحبيبات مع المادة الطافية المتبقية.

انقل الخليط من كل أنبوب إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 2 ملليلتر ، وجهاز طرد مركزي عند 200 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة مسبقا.

استخدم طرف ماصة مبردة لتطبيق 50 ميكرولترا من هذا التعليق على وسط بئر في لوح سعة 24 بئرا. يجب أن تظهر هذه العينة على شكل قبة. كرر عملية التطبيق هذه تسع مرات لملء 10 آبار إجمالية.

انقل الصفيحة المكونة من 24 بئرا إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بالبلمرة. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط الأمعاء البشرية المصغرة كاملة إلى كل بئر. استمر في الحضانة في نفس الظروف ، مع التأكد من استبدال هذه الوسائط كل يومين.