رسم الدوائر العصبية المثبطة بواسطة المسح الضوئي ليزر ضوئي
أكتوبر 6, 2011
تقدم هذه الورقة مقاربة الجمع بين المسح الضوئي ليزر ضوئي مع تسجيلات خلية كاملة في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا العصبية المثبطة محدودة السكان. هذه التقنية تسمح لرسم الخرائط والتحليل الكمي واسعة النطاق للدوائر المحلية متشابك من الخلايا العصبية المثبطة محددة القشرية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في التنظيم الوظيفي المحلي للدوائر العصبية المثبطة. يبدأ الإجراء بإعداد شرائح الدماغ الحية من القشرة الحسية الجسدية الأولية للفئران. الخطوة التالية هي التصور والتسجيل من GFP المستهدف الذي يعبر عن أنواع الخلايا المثبطة في شريحة الدماغ.
بعد تحفيز صور المسح بالليزر عن طريق الغلوتامات ، يتم استخدام فك المسح لتنشيط مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية قبل التشابك كمثير أو مثبط. يتم تسجيل تيارات ما بعد التشابك في GFP التي تعبر عن الخلايا العصبية البينية. الخطوة الأخيرة هي الانتقال من خلال تحفيز الصور وتحليل البيانات وإنشاء خرائط كمية للمدخلات المشبكية للخلايا العصبية المسجلة.
في النهاية ، يتيح تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر جنبا إلى جنب مع تسجيلات الخلية بأكملها إنشاء خرائط مفصلة للمدخلات المشبكية لأنواع معينة من الخلايا العصبية المثبطة ، والتي قد تسمح بتحديد تنظيم ووظيفة الدوائر القشرية المثبطة المحلية. كانت التقنية القائمة على تحفيز الصور رائدة من قبل الدكتور لاري كاتز ، نيد كالواي ، وتم تطويرها بشكل أكبر من قبل الدكتور كارولز وابودا ، بي بي ، الدكتور شينغ زي الذي تدرب مع الدكتور دكتور كالواي ، معهد سالك ، حيث قاد العديد من الدراسات التي تبحث في الدوائر بين الفم. تقوم مجموعتنا حاليا بتوسيع هذه الدراسات ومواصلة هذه الدراسات ، والتحقيق في الدوائر بين الفم.
لبدء هذا الإجراء ، قم بالتضحية بفأر معدل وراثيا بعد الولادة لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع عن طريق قطع الرأس وإزالة الدماغ بسرعة ، ضع الدماغ في محلول قطع مجمد ومؤكسج. ثم استخدم نظارات GFP لفحص الدماغ بصريا والتحقق من تعبير GFP. بعد ذلك ، قم بتقطيع القشرة الحسية الجسدية الأولية إلى أقسام بسماكة 400 ميكرومتر باستخدام هزاز.
احتضان الشرائح في السكروز الذي يحتوي على السائل الدماغي النخاعي فقاعات مع 95٪ O2 و 5٪ CO2 عند 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى السائل النخاعي العادي في درجة حرارة الغرفة لتجهيز الليزر للتجربة ، وقم بتشغيل نظام التبريد بالليزر ومصدر الطاقة. ثم قم بتشغيل جميع الأجهزة المتعلقة بالتحكم في تحفيز الصورة ، بما في ذلك نظام مرآة المسح الضوئي والمغير البصري والمصراع الإلكتروني ، ومكبر صوت إدخال الصمام الثنائي الضوئي.
بعد ذلك ، قم بتشغيل معدات الفيزيولوجيا الكهربية مثل مكبر الصوت متعدد المشبك 700 B ومعالجات صغيرة. يتم إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية والتحفيز الضوئي والتصوير في غرفة نضح الشريحة المثبتة على المرحلة الآلية للمجهر. بعد ذلك ، قم بتشغيل كاميرا التصوير ، وسيتم تصور الشريحة في المجهر المستقيم باستخدام DIC بالأشعة تحت الحمراء وبصريات الفلورسنت epi من خلال نظام التصوير.
ثم افتح برنامج FS المستند إلى MATLAB وبرنامج كاميرا الالتقاط Q على الشاشة. قبل إجراء التجربة ، تحقق من نظام تحفيز الصور بالليزر وتأكد من أنه في حالة عمل. ضع قطعة من الورق تحت هدف المجهر الرباعي لمراقبة نمط المسح بالليزر أثناء تشغيل النظام.
لصنع القطب الصغير بمقاومة OM من أربعة إلى ستة ميجا، اسحب قطبا كهربائيا زجاجيا باستخدام مجتذب الماصة. ثم املأ القطب بمحلول داخلي يحتوي على 0.1٪ بيوتين لوضع العلامات على الخلايا وتحديد المورفولوجيا. بعد ذلك ، قم بتشغيل نظام التروية المضغوط لضخ السائل الدماغي النخاعي في الغرفة.
تأكد من وجود مستوى سائل ثابت يبلغ 2.0 ملم فوق الشريحة في الغرفة. يضاف حصة من محلول مخزون الغلوتامات المحبوسة MNI إلى 25 مل من السائل الدماغي النخاعي المتداول بتركيز 0.2 ملليمولار من الغلوتامات المحبوسة. ثم انقل شريحة دماغ واحدة إلى غرفة التسجيل.
قم بتشغيل نظام التصوير للتحقق من جودة الشريحة وتحديد موقع المنطقة الحسية الجسدية الأولية تشريحيا. بعد ذلك ، قم بتثبيت الشريحة بحلقة بلاتينية وترية مصنوعة خصيصا ، واحرص على عدم وضع المرساة فوق منطقة الدماغ المخصصة للتسجيل. تصور الخلايا بهدف 60 × بناء على تصور تعبير GFP تحت مجهر الفلورسنت DIC.
تحديد وتحديد أنواع الخلايا المثبطة. يرجى ملاحظة أنه سيتم إجراء التسجيل تحت التحكم البصري بمساعدة DIC بالأشعة تحت الحمراء. تعد مراقبة الفيديو والتبديل بين DIC ووضعي الفلورسنت ضروريين لتأكيد موقع خلية GFP أثناء خفض القطب الكهربائي إلى الخلية المستهدفة.
باستخدام تقنية لقط التصحيح التقليدية. أولا ، قم بالضغط الإيجابي على القطب. حركه بالقرب من سطح الخلية لإنشاء غمازة ملحوظة على غشاء الخلية المستهدف.
ثم قم بتطبيق الضغط السلبي بسرعة لتشكيل ختم جيجا وكسر الخلية أثناء مراقبة استجابات الحقن الحالية على شاشة الفيديو. عند اقتحام الدخول ، التقط صورا ل GFP المسجلة التي تعبر عن الخلايا العصبية داخل الخلايا العصبية بتكبير 60 × تحت وضعي DIC والفلورسنت للتحقق عبر الإنترنت. قبل جمع بيانات التحفيز الضوئي ، قم بحقن نبضات التيار فرط الاستقطاب وإزالة الاستقطاب لفحص الخصائص الفيزيولوجية الكهربية الأساسية لكل خلية.
بمجرد استقرارها ، يتم تحقيق تسجيل الخلية بأكملها بمقاومة وصول جيدة ، والتي عادة ما تكون أقل من 20 ميجا أوم ، قم بتبديل هدف المجهر من 60 × إلى أربعة × تكبير لتحفيز صور المسح الضوئي بالليزر ، والحصول على صورة شريحة بتكبير أربعة × واستخدامها لتوجيه وتسجيل مواقع تحفيز الصورة. اضبط معلمات تحفيز الصور والحصول على البيانات عن طريق تنشيط وحدة تبديل التكوين الخاصة ب phys. استخدم نبضة ليزر مللي ثانية واحدة تبلغ حوالي 20 مللي واط مع فاصل تحفيز يبلغ ثانية واحدة.
لرسم خرائط تحفيز الصور ، احصل على آثار بيانات لثانية واحدة تم أخذ عينات منها عند 10 كيلو هرتز. بعد ذلك ، قم بتحميل صورة الشريحة الأربعة × في وحدة مخطط الطبع. حدد موقع سوما وقم بإعداد مواقع تحفيز الصور بنمط 16 × 16 مع 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر.
التباعد حول موقع الخلية ، والذي يغطي جميع الطبقات القشرية. ثم قم بتعيين ملف تعريف الإثارة للخلايا العصبية المسجلة من خلال فحص مواقع الارتفاع استجابة لتحفيز الصورة في وضع المشبك الحالي. يسهل برنامجنا سهل الاستخدام مع ميزات العرض عبر الإنترنت تجارب رسم الخرائط.
بعد ذلك ، قم بتعيين اتصالات الدوائر المثيرة المحلية عن طريق اكتشاف التيارات المثيرة بعد التشابك من الخلية المسجلة باستخدام المسح بالليزر في مواقع مختلفة ، احتفظ بالخلية عند سالب 70 مللي فولت في وضع مشبك الجهد للكشف عن التيارات المثيرة الداخلية. ثم كرر خرائط التيار المثير بعد التشابك مرتين إلى ثلاث مرات مع تدوير نمط تحفيز الصورة أو قلبه. لتعيين توصيلات الدوائر المثبطة المحلية ، اكتشف التيارات المثبطة بعد التشابك من الخلية المسجلة.
امسك الخلية بالقرب من صفر مللي فولت في هذه الحالة ، سالب 15 مللي فولت في وضع مشبك الجهد من أجل اكتشاف التيارات المثبطة الخارجية. بعد الانتهاء من جميع المقايسات الفسيولوجية ، قم بإزالة القطب برفق من الخلية المسجلة. قم بإزالة شريحة الدماغ من الغرفة ، ثم قم بإصلاحها في 4٪ من الفورمالديهايد طوال الليل ، وقم بتلطيخ الخلايا المسجلة ضد البيوتين.
في هذه التجربة ، يتم استخدام مزيج من تعبير GFP والفيزيولوجيا الكهربية الجوهرية والخصائص المورفولوجية لتصنيف الخلايا العصبية المثبطة. تفعيلك. فيما يلي المثال وخريطة البيانات الأولية لتوضيح تحفيز صور المسح الضوئي بالليزر ، والذي يسمح برسم خرائط واسعة النطاق لاتصالات الدوائر القشرية المحلية بالخلايا العصبية المثبطة المسجلة. فيما يلي أمثلة على خرائط الإدخال الكمية المشفرة بالألوان المشتقة من الآثار الأولية الموضحة للتو في الشكل D ، حيث يتم ترميز اتساع الأحداث المشبكية المكتشفة في الخلايا العصبية البينية المسجلة بالألوان وتثبيتها طوبوغرافيا على مواقع تحفيز الصورة.
يشار إلى موقع جسم الخلية بالدائرة الحمراء المفتوحة في شريط المقياس. تشير الألوان الدافئة إلى مدخلات متشابكة قوية وتشير الألوان الباردة إلى ضعف الاتصال أو عدم الاتصال بالخلية المستهدفة. وبالمثل ، يعرض الشكل E عدد الأحداث المشبكية لكل موقع غير محدد للعينة إلى الخلايا العصبية المسجلة.
يوضحالشكل F وقت بداية أول حدث متشابك تم اكتشافه إلى الخلية المسجلة بعد تحفيز الصورة في شريط المقياس. تشير الألوان الدافئة إلى الإدخال القصير وزمن الوصول والألوان الأكثر برودة تشير إلى زمن انتقال متشابك أطول. وبالتالي ، يتيح LSPS إنشاء خرائط مفصلة للموضع والقوة والكمون وعدد المدخلات التي تؤثر على أنواع معينة من الخلايا العصبية المثبطة.
حسنا ، عند حضور هذا الإجراء ، من المهم التحلي بالصبر ، وجعل حالة التجربة نظيفة ، ولكن الخلايا العصبية بشكل فعال وحذر شديد للتغيير من تكبير عالي للجسم إلى تعديل منخفض. ثم آخر استخدام لبرنامج الأرض بشكل جيد للغاية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لرسم الخرائط وتحليل الدوائر المشبكية المحلية للعصبونات القشرية المثبطة المحددة باستخدام التحفيز الضوئي بالمسح بالليزر مقترنًا بتسجيلات الخلايا الكاملة في الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن GFP. يتيح هذا النهج تحقيقًا مفصلًا للتنظيم الوظيفي للدوائر العصبية المثبطة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكهربية الفسيولوجية
- الدوائر العصبية
الخلفية
- تلعب الخلايا العصبية المثبطة دورًا حاسمًا في تنظيم الدوائر العصبية.
- تتيح الفئران المعدلة وراثيًا التي تعبر عن GFP إجراء دراسات مستهدفة لمجموعات معينة من الخلايا العصبية.
- فهم الدوائر المشبكية المحلية ضروري لتوضيح وظيفة الدماغ.
- التحفيز الضوئي بالمسح بالليزر هو أداة قوية لدراسة التفاعلات المشبكية.
غرض الدراسة
- للتحقيق في التنظيم الوظيفي المحلي للدوائر العصبية المثبطة.
- لرسم خرائط المدخلات المشبكية للعصبونات المثبطة المحددة.
- لتعزيز فهم الديناميات المشبكية في الشبكات القشرية.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح الدماغ الحية من القشرة الحسية الجسدية الأولية للفئران.
- التصور والتسجيل من أنواع الخلايا المثبطة المستهدفة التي تعبر عن GFP.
- التحفيز الضوئي بالمسح بالليزر لتفعيل الخلايا العصبية المشبكية السابقة.
- تحليل البيانات لتوليد خرائط كمية للمدخلات المشبكية.
النتائج الرئيسية
- النجاح في رسم خرائط الدوائر المشبكية المحلية في العصبونات المثبطة المحددة.
- كشف التحليل الكمي للمدخلات المشبكية أنماطًا متميزة.
- أظهر فعالية التقنية المدمجة لدراسة الدوائر العصبية.
- قدم رؤى حول التنظيم الوظيفي للشبكات المثبطة.
الاستنتاجات
- تقدم الطريقة نهجًا قويًا لدراسة الدوائر المثبطة في الدماغ.
- تساهم النتائج في فهم التفاعلات المشبكية في الخلايا العصبية القشرية.
- يمكن تطبيق هذه التقنية لاستكشاف ديناميات الدوائر العصبية بشكل أكبر.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Mapping inhibitory neuronal circuits provides mechanistic de-risking for target validation in CNS drug discovery by revealing functional synaptic organization. This approach supports predictive confidence in pathway modulation strategies and enables data-driven triage of therapeutic hypotheses. The technique enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment of circuit-level drug effects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping synaptic inputs to specific inhibitory neuron subtypes, clarifying pathway engagement.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative assessment of circuit-level target modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing functional consequences of target inhibition on local network dynamics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining baseline synaptic input patterns.
- Reproducibility: Generates quantitative maps of synaptic inputs that enable standardized comparison across experimental conditions.
- Platform Utility: Supports scalable compound evaluation by providing circuit-level readouts of neuronal response.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maps inhibitory circuits in disease-relevant systems to align with translational biomarker strategies.
- Preclinical Continuity: Connects discovery-phase circuit mapping to preclinical validation of network-level drug effects.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing compensatory or paradoxical circuit responses to target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing circuit-level functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping synaptic organization of inhibitory neurons.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible quantification of synaptic inputs to recorded neurons.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of synaptic strength, latency, and input number to facilitate condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling circuit-level assessment of drug effects in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for iterative circuit mapping across target classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic de-risking of circuit-level effects.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of synaptic input mapping across laboratories and studies.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk from unanticipated circuit adaptations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative circuit modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, laser scanning photostimulation, and transgenic mouse handling.
- Dependent on laser scanning photostimulation systems, electrophysiology rigs, and fluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation parameters, voltage-clamp settings, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying to different cortical regions or disease models.
- Limited by tissue viability and the need for healthy brain slices to ensure reliable synaptic responses.
