موسوعة JoVE للتجارب
علم الأعصاب
0 مشاهدة • 2:38 دقيقة • April 28th, 2025
خذ كرويات ورم الغدد الصم العصبية في الأمعاء الدقيقة في أنبوب.
أضف حلا مثبتا للحفاظ على الخلايا.
لغسل أجهزة الطرد المركزي واستبدال المثبت بالمخزن المؤقت.
وتخلص من المادة الطافية لإزالة أي مثبت متبقي.
أضف عازلة تحتوي على منظف وعامل مانع لاختراق الأغشية الخلوية ومنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
اغسل بمخزن مؤقت لإزالة المنظفات الزائدة وعامل الحظر.
احتضان بالأجسام المضادة الأولية ، والتي ترتبط بالبروتين المستهدف الخاص بخلية الغدد الصم العصبية.
اغسل بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أضف الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية.
اشطفها بمخزن مؤقت لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
أضف وسيطا متصاعدا يحتوي على صبغة لتلطيخ النواة.
انقل الكرات على شريحة وقم بتثبيتها بقلة غطاء.
استخدم مجهر مضان لتصور خلايا الغدد الصماء العصبية للكروية التي تعبر عن بروتينات معينة.
قم بإصلاح العضيات عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد واحتضانها لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، اغسل المزرعة مرتين باستخدام 1 مليلتر من PBS. أضف 500 ميكرولتر من PBS مع 3٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 لاختراق الثقافة. احتضن الأنبوب لمدة خمس دقائق ، ثم اغسل العضيات ثلاث مرات باستخدام 1 مليلتر من PBS و 3٪ BSA.
بعد ذلك، احتضن المزرعة بالأجسام المضادة الأولية لمدة ساعة واحدة، ثم كرر عمليات الغسيل باستخدام PBS و BSA. احتضن بالأجسام المضادة الثانوية وكرر الغسيل ، مع التأكد من الشفط والتخلص من جميع المواد الطافية
لتصوير الكرات الكروية، أضف 5 ميكرولترات من وسط التركيب الذي يحتوي على DAPI، واستخدم ماصة P20 لنقل 5 ميكرولترات من الكرويات إلى شريحة زجاجية. أغلق الشريحة بقلة غطاء ، وقم بالصورة بمجهر مضان باستخدام أهداف 10 و 20 و 40 مرة.