قياس نشاط ناهض في مستقبلات البروتين يقترن G

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقدير ثابت الألفة النسبية KB لمنشط تجاه الحالة النشطة للمستقبل من خلال تحليل منحنى الاستجابة للتركيز. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قياس منحنيات الاستجابة للتركيز لمجموعة من المنشطات لاستثارة استجابة عند مستقبل مقترن ببروتين G. وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في تقدير قيم eemax و EC 50 للمنشطات باستخدام تحليل الانحدار غير الخطي.

تُستخدم هذه القيم بعد ذلك لحساب التقديرات الأولية للمعاملات لتحليل الانحدار غير الخطي اللاحق الذي يتضمن النموذج التشغيلي. وكخطوة نهائية، يتم الحصول على التقديرات النسبية لثوابت الألفة للمنبهات في الحالة النشطة للمستقبل باستخدام تحليل الانحدار غير الخطي الشامل لمنحنيات الاستجابة للتركيز الخاصة بها. وفي نهاية المطاف، وباستخدام صيغة معدلة من النموذج التشغيلي، يمكن تقدير ثابت ألفة المنبه للحالة النشطة للمستقبل بالنسبة لثابت ألفة منبه آخر من خلال تحليل الانحدار غير الخطي الشامل لمنحنيات الاستجابة للتركيز الخاصة بهما.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اكتشاف الأدوية، مثل: هل يتمتع الناشط بانتقائية لمسار تأشير محدد؟ وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب تفاصيل التحليل الرياضي. ولتقدير قيم KB النسبية للناشط، يلزم وجود سلسلة من منحنيات الاستجابة لتركيز الناشط، بحيث لا تقل عن منحنيين.

يمكن العثور على مناقشة للاعتبارات الخاصة بهذه التجارب في البروتوكول المكتوب. بعد الحصول على منحنيات الاستجابة، اطرح الاستجابة الأساسية من الاستجابة المقاسة في وجود كل تركيز من المادة المحفزة، ثم ابدأ في إدخال البيانات الناتجة عن تجارب الاستجابة للتركيز في جدول بيانات. في برنامج Prism، يتم إدخال جميع لوغاريتمات تركيزات المادة المحفزة تحت العمود المسمى X. وتُدخل قياسات الاستجابة للمادة المحفزة التي يبدو أنها تمتلك أكبر استجابة قصوى أو قيمة eax في العمود A، بينما تُدخل قياسات المواد المحفزة الأخرى في الأعمدة المجاورة المرمزة بأحرف.

أدخل قياسات المكررات لمنحنيات الاستجابة للتركيز في الأعمدة الفرعية لعمود محدد بحرف. اختر ورقة الرسم البياني التي رُسمت عليها البيانات، ثم اختر "تحليل" (analyze) لتحليل البيانات باستخدام تحليل الانحدار غير الخطي وفقاً لمعادلة الميل المتغير، مع تقييد المعلمة "القاع" (bottom) عند الصفر، ثم أجري تحليل الانحدار. سجل قيم المعلمات "القمة" (top) وlog EC 50 لاستخدامها في حساب تقديرات المعلمات الأولية.

لحساب تقديرات المعاملات الأولية، يتم تعيين قيمة log tau K المرصودة لتكون مساوية للقيمة السالبة لـ log EC 50 للمحفز القياسي. بعد ذلك، يتم حساب قيمة log RAI لكل محفز اختباري كلوغاريتم الكمية الناتجة عن حاصل ضرب قيمة eemax للمحفز الاختباري في EC 50 للمحفز القياسي مقسوماً على حاصل ضرب قيمة emax للمحفز القياسي في EEC 50 للمحفز الاختباري. في هذه المعادلة، يُشار إلى معاملات المحفز القياسي باستخدام علامة الاقتباس (').

بعد ذلك، يتم تعيين ثابت الألفة اللوغاريتمي للمنبه المختبر كقيمة اللوغاريتم السالب لقيم EC الخاصة بكل منها. وبعد إدخال البيانات في برنامج Prism، تأكد من إدخال البيانات الخاصة بالمنبه الذي سجل أكبر قيمة EMAX في العمود A. يتم الآن تعيين هذا المنبه كمعيار، بينما تُعين المنبهات الأخرى كمنبهات اختبار. بعد ذلك، أدخل معادلة محددة من قبل المستخدم log, RAI في برنامج prism على عدة أسطر.

في هذه الحالة، تتضمن المعادلة التي حددها المستخدم ما مجموعه خمسة من المناهضات. أدخل تقديرات المعاملات الأولية للمستقبل R وثابت الألفة للمناهضات المختبرة. يتم تعيين قيمة EMAX للمناهض القياسي لـ M sis، بينما يتم تعيين قيمة واحد لـ M.

أدخل الآن التقديرات الأولية لمعلمات قيم log RAI للمنبهات المختبرة. قم بتطبيق قيود المعلمات عن طريق تقييد log K₁ عند الصفر، وتعيين قيمة مشتركة لـ log GR و m و sis و M لجميع مجموعات البيانات. بعد ذلك، ابدأ تحليل الانحدار غير الخطي.

تؤدي النتائج إلى استخلاص قيم log K الملحوظة وقيم log RAI للمنبهات المختبرة لتقدير قيم KB للمنبهات بوحدات مطلقة من الوحدات المولارية العكسية، حيث تُستخدم فحوصات مخبرية تعتمد على الخلايا والتي تظهر نشاطاً مستمرّاً للمستقبل. اختر المنبهات وصمم التجربة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. احسب النشاط المستمر للمستقبل والاستجابة لكل تركيز من المنبه على أنها الاستجابة المقاسة ناقص الاستجابة الأساسية في الخلايا غير المحولة بالمستقبل الموضحة هنا؛ وهي استجابات لمنبهات مختلفة تم حسابها بهذه الطريقة لمسار تأشيري يظهر نشاطاً مستمرّاً منخفضاً جداً للتحليل الأولي.

أولاً، أدخل البيانات في برنامج Prism كما هو موضح للنشاط غير التأسيسي. اضغط موافق. أدخل أيضاً الاستجابة الناتجة عن النشاط التأسيسي للمستقبل في الأعمدة المرمزة بالحروف المناسبة في الصف المقابل لتركيز الـ agonist بلوغاريتم سالب 20. يتم هنا إدخال لوغاريتم سالب كبير لتقريب تركيز الـ agonist إلى صفر.

حلل البيانات كما سبق، باستثناء أنه بالنسبة للنشاط التأسيسي، يجب تقييد المعلمة bottom بحيث تكون مشتركة لجميع مجموعات البيانات. سجل المعلمة المشتركة بالإضافة إلى المعلمتين top و log EC لكل محفز. بعد تحديد ثابت log affinity للمحفز القياسي في تجارب منفصلة، احسب التقدير الأولي لقيمة log K observed لكل محفز جزئي مختبر باعتباره لوغاريتم التعبير المكون من الفرق بين قيمة emax للمحفز القياسي والمحفز المختبر مقسوماً على حاصل ضرب EC 50 والفرق بين قيمة eemax للمحفز القياسي والاستجابة التأسيسية.

قم بحساب التقدير الأولي لـ log KB لكل ناهض والتقدير الأولي لـ log T cis لتقدير قيم KB للناهضات. أدخل البيانات في برنامج Prism ثم أدخل معادلة محددة من قبل المستخدم. يتم إدخال Log KB في Prism على عدة أسطر كما هو موضح هنا في حالة وجود ناهضين.

بعد ذلك، أدخل تقديرات المعلمات الأولية عن طريق إدخال وضع الألفة لكل ناهض. يتم تعيين تقدير log T sis وتقدير M sis وتقدير M، حيث يتم تعيين قيمة EMAX للناهض القياسي لـ M sis، وتعيين قيمة واحد لـ M. وأخيراً، أدخل التقديرات الأولية لـ log kb.

قم بتطبيق قيود المعلمات عن طريق تقييد log K one بالقيمة المحددة مسبقاً، وعن طريق تعيين log T sis و m sis و M إلى قيمة مشتركة لجميع مجموعات البيانات. ابدأ تحليل الانحدار غير الخطي. تعطي النتائج قيمة log KB للمنبه القياسي، و log K الملاحظ، وقيم log KB للمنبهات الجزئية.

إن الاستجابة القصوى للنظام، وقيمة log T cys لمعقد المستقبل الحر، وعامل ميل المحول في النموذج التشغيلي الموضح هنا هي تحلل الفسفوإينوسيتيد المستحث بواسطة ناهضات المسكارين في خلايا مبيض هامستر صيني، والتي تعبر بشكل مستقر عن مستقبل المسكارين M3. تم قياس منحنيات الاستجابة للتركيز لنواهض مسكارين مختارة في هذا المقايسة، وحُللت البيانات كما هو موضح هنا لتقدير قيمة KB لكل ناهض معبراً عنها بالنسبة لقيمة Oxo Tremaine M. وتمثل المنحنيات النظرية أفضل مطابقة لمربعات المجموع لمعادلة الانحدار مع البيانات. تظهر تقديرات log RAI لكل من kabale و a recline و pilocarpine و McNeil.

أ 3، 4 3. تم تحديد التقديرات المقابلة للاستجابة القصوى للنظام وعامل ميل المحول. كما تم إيجاد قيم log K الملاحظة لكل من المواد المحفزة الموضحة.

إليك نتائج التجارب على تحلل الفوسفاتيديل إينوزيتول المحفز بمؤثرات المسكارينية في خلايا HC 2 93. أدى التعبير العابر للمستقبل المسكاريني M three في الخلايا التي تعبر بشكل مستقر عن G alpha 15 إلى زيادة في التحلل الأساسي للفوسفاتيديل إينوزيتول، وهو ما عُزي إلى النشاط التلقائي للمستقبل. تم تحليل البيانات لتقدير قيم log KB لكل من Oxo Tremaine M و MacNeil, A 3 43.

تمثل المنحنيات النظرية ملاءمة المربعات الصغرى لمعادلة الانحدار مع البيانات. وتظهر تقديرات log KB لكل من Oxo Tremoring M وMcNeil, A 3 43. كما تم تحديد قيمة K observed المقدرة لـ McNeil A 3 43.

بمجرد إتقان تقنية تحليل البيانات هذه، يمكن إجراؤها في غضون بضع دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقدير قيم KB النسبية والفعلية من منحنيات الاستجابة للتركيز للمنبهات (agonists) لاستثارة استجابة لاحقة في مسار التأشير الخاص بالمستقبل المقترن بالبروتين G.