PDMS تصنيع الأجهزة وتعديل السطح

اسمي كين كوتز، وأنا باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه هنا في مركز Bio MAs Resource Center التابع لمستشفى ماساتشوستس العام. يتضمن مشروعي البحثي الرئيسي عزل الخلايا المتعادلة (neutrophils) باستخدام جهاز التقاط قائم على الألفة المناعية مزود بتراكيب مائعية دقيقة.

نستخدم هذا الجهاز في خمس مستشفيات مختلفة في أنحاء البلاد لعزل RNA من أجل التحليل الجينومي اللاحق. يتكون الجهاز بشكل أساسي من طبقة رئيسية من SU8 المقاوم للضوء فوق السيليكون. سنقوم بصب مادة إيلاستومر مكونة من جزأين وهي PDMS فوق تلك الطبقة الرئيسية، ومن ثم سيتشكل قالب من مادة PDMS هذه.

نقوم بإزالة القالب الرئيسي من علبته ووضعه في طبق بتري. يتم تثبيت القالب الرئيسي باستخدام شريط لاصق في قاع طبق بتري. وباستخدام الميزان، نقوم بوزن خليط من PDMS والمصلب والراتنج الأساسي.

تكون النسبة جزءاً واحداً من المصلب إلى 10 أجزاء من الراتنج. وعادةً، بالنسبة للأجهزة التي تم قصها، نقوم بوزن 20 إلى 30 جراماً من الراتنج، واثنين إلى ثلاثة جرامات من المصلب على التوالي. وبعد سكب كل من المصلب والراتنج في قارب وزن صغير، نستخدم شوكة بلاستيكية قياسية لخلطهما معاً.

يجب التأكد من الخلط بقوة وطي المزيج فوق بعضه البعض لضمان توزيع المصلد بالتساوي داخل الراتنج. وعادةً ما نراقب مدى جودة خلط المكونين؛ فمن خلال النظر إلى عدد فقاعات الهواء، نحاول الوصول إلى توزيع متساوٍ لفقاعات هواء صغيرة في جميع أنحاء الإلاستومر.

بعد ذلك، نقوم بسكب PDMS فوق قالب SU eight الموجود في طبق بيتري. نضع القالب وعليه PDMS داخل جرة فراغية، ونقوم بتفريغ الغرفة لإزالة فقاعات الهواء التي اختلطت به. عادةً ما تستغرق عملية إزالة الغازات من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة.

بعد عملية إزالة الغازات، نخرج الأجهزة من غرفة التفريغ ونضعها في فرن عند درجة حرارة تتراوح من 65 إلى 80 °C. الحد الأدنى لوقت المعالجة عند درجات الحرارة هذه هو ثلاث إلى ست ساعات. وفي مختبرنا، عادةً ما نترك الأجهزة في الفرن طوال الليل.

عادةً ما نستخدم سكيناً جراحياً من الفولاذ مقاس 11. نقوم بعمل قطع مستقيمة لعمق نصف سنتيمتر تقريباً من حافة القالب السيليكوني الأساسي، ونقطع حول حافة القالب لتشكيل قرص كبير. ثم نقشر قالب PDMS من القالب الأساسي ونضعه بحيث يكون جانب الميزات متجهاً للأعلى في طبق بتري نظيف.

نقوم بإخراج العفن المتحرر من طبق بتري ونضعه على سطح قطع باستخدام إما سكين أو سكين مثبت على سكة خطية. نقوم بتقطيع الأجهزة الموجودة على العفن، ثم يوضع كل جهاز مقطع مرة أخرى في طبق بتري لإتمام عمليات المعالجة اللاحقة.

عادةً، ومن أجل ربط أجهزتنا بالسوائل، نقوم بثقب ثقوب في جهاز PDMS. والجهاز الذي نستخدمه لثقب الثقوب هو محقنة قياسية بحجم 3 مليمتر. ويوجد عند طرف محقنة الـ 3 مليمتر إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف غير مدبب.

يوجد داخل الإبرة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ سلك يتناسب مع القطر الداخلي للإبرة. هذا السلك متصل بمكبس المحقنة. ومن خلال سحب المكبس إلى الخلف وتراجع تلك الإبرة، يمكنك ثقب ثقب أو اقتطاع سدادة في الـ PDMS. اقلب جهاز الـ PDMS وقم بطرده عن طريق الضغط على المكبس.

يكمن السر في استخدام أجهزة الثقب في الحفاظ على المكبس عمودياً قدر الإمكان وعدم تدوير جهاز الثقب على الإطلاق. عند الثقب عبر PDMS، تقوم برفع الجهاز بأكمله، أي جهاز PDMS كاملاً، باستخدام ملقط، ثم قلبه، وإخراج السدادة عن طريق الضغط لأسفل على المكبس. ثم تلتقط السدادة باستخدام ملقط وتتخلص منها.

بعد ذلك، تقوم بسحب المكبس مرة أخرى، ثم تقلب الجهاز لأسفل وتخرج أداة القطع. كرر هذه العملية حتى يتم ثقب جميع الفتحات المطلوبة. أما بالنسبة لعملية الربط، فنحن نقوم بربط أجهزة PDMS بالشرائح الزجاجية.

بالنسبة لأجهزتنا، سنقوم بربط PDMS بشرائح زجاجية برباط غير عكسي أو تثبيته تساهمياً. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضعها في جهاز plasma Asher وتعريضها لبلازما أكسجين تفاعلية. لذا، تتمثل خطوات القيام بذلك في أخذ جهاز PDMS ووضعه على صينية جهاز plasma Asher.

بينما تكون ميزات الجهاز مواجهة للأعلى، يمكنك استخدام أي شريحة مجهر زجاجية قياسية. نحن نستخدم شريحة مجهر أكبر قليلاً بطول بوصة ونصف لتناسب جهازنا. يمكنك استخدامها مباشرة من العبوة.

نفضل معالجتها باستخدام محلول بيرانا؛ حيث يعمل ذلك على إزالة أي ملوثات عضوية قد تكون موجودة على سطح الشريحة الزجاجية. وبعد وضع الجهاز والشريحة الزجاجية فوق صينية جهاز الحرق بالبلازما (plasma Asher)، قم بتمرير الصينية إلى داخل الجهاز وتعريضها لبلازما الأكسجين التفاعلية.

بعد اكتمال برنامج جهاز تنظيف البلازما (plasma Asher)، نفتح الغرفة وننقل اللوحة التي تحتوي على أجهزتنا إلى سطح المختبر. وباستخدام الملاقط، نرفع جهاز PDMS بعناية، مع الحرص على عدم لمس أسطح الربط بأصابعنا. ثم نقلب جانب الربط فوق الشريحة الزجاجية، ونتأكد من عدم وجود فقاعات هوائية بين PDMS والشريحة الزجاجية.

نضع جهاز PDMS المرتبط الآن بالزجاج على لوح تسخين عند درجة حرارة 65 إلى 75 درجة C لمدة 10 دقائق لتحقيق ارتباط كيميائي أفضل. لذا في هذا الجزء، وفي هذا القسم، سنقوم بتعديل أسطح PDMS والزجاج كيميائياً بعد عملية الربط في الغرفة النظيفة، حيث يتبقى لدينا سطح PDMS يحتوي على مجموعات OL التفاعلية على السطح. نحن بحاجة إلى هذا السطح التفاعلي لكونه محباً للماء، والذي سينتشر في النهاية إلى داخل كتلة PDMS.

لتحقيق أفضل نتائج لكيمياء السطح، يتم ذلك مباشرة بعد المعالجة بالبلازما، لذا سنستخدم محلولاً بتركيز 5% من الـ me capto. وهو عبارة عن three me capto, propyl, trimeth oxy. هذا المحلول بتركيز 5% حجماً، وما نقوم به أساساً هو حقنه في المدخل والتأكد من ملء الجهاز بالكامل دون وجود أي فقاعات هوائية.

إذا وجدت أي فقاعات هوائية، قم بدفعها للخارج باستخدام الملاقط. وبمجرد حقن الـ slan، اتركه لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وعادةً ما يتم حقن حجم ثانٍ من الـ slan بعد 10 دقائق من بدء التفاعل.

بعد تفاعل السيلان لمدة نصف ساعة تقريباً، سنقوم بغسل جميع الأجهزة بـ 3 إلى 4 أحجام من الإيثانول النقي. أما الكمية الزائدة التي يتم طردها، فسنقوم بمسحها باستخدام منديل كيميائي. بعد شطف الأجهزة، نرفعها ونضعها على لوح تسخين مضبوط على درجة حرارة 100 °C، ونترك الإيثانول الموجود بداخلها يتبخر، وهذا يساعد في معالجة سطح السيلان.

بمجرد جفاف الجهاز، يمكن تخزينه في مجفف لعدة أشهر، أو يمكنك أخذ الجهاز والمتابعة فوراً إلى الخطوة التالية. بعد معالجة الأجهزة، تصبح الآن مغطاة بطبقة من الساين على كل من سطح الزجاج وسطح PDMS. هذا الساين هو capto sine يحتوي على مجموعة ثيول، والتي ستتفاعل مع الرابط المتقاطع ثنائي الوظائف غير المتجانس، وهو GMBS.

يتم تخفيفه في الإيثانول النقي. وهو يتفاعل مع الماء، لذا يجب الحرص على عدم تعريضه للظروف المائية. نقوم بحقنه في الأجهزة ونزيل أي فقاعات هوائية باستخدام الملاقط كما أفعل هنا للتأكد من أن جميع الأسطح مغطاة بهذا الجزيء.

نقوم بتغطيته ونتركه يتفاعل لمدة نصف ساعة. بعد تفاعل GMBS لمدة نصف ساعة، سنقوم بشطف الأجهزة بماء منزوع الأيونات لإزالة أي آثار للإيثانول الموجودة في الجهاز. ثم سنقوم بتمرير NeutrAvidin، وهو بروتين رابط للبيوتين.

يتم تخفيف neutravain مسبقاً ليصل تركيزه إلى 10 micrograms لكل مل. وفي حال حقن أي هواء في الجهاز عن طريق الخطأ، سيتطلب الأمر شطف الجهاز مرة أخرى باستخدام الإيثانول لإزالة جميع الفقاعات الهوائية بفعالية؛ حيث يعمل الإيثانول على ترطيب أسطح الجهاز بشكل أفضل، مما يسمح بإزالة أي فقاعات هوائية قد تكون دخلت الجهاز عرضياً. وبمجرد شطف الأجهزة بالماء المتأين، نقوم عادةً بملء الجهاز بما يعادل مرتين إلى أربع مرات من حجم الجهاز من محلول neutravain المخفف.

سيتفاعل الـ Nutt travain مع الـ GMBS، والذي يتم تثبيته على السطح من خلال أي وسيلة أولية موجودة على الـ Nutt travain. يمكن أن تحدث هذه العملية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وعادةً ما أقوم بوضع الأجهزة في الغرفة الباردة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

ومع ذلك، قبل إضافة الجسم المضاد، نرغب في شطف أي Aden غير مرتبط في المحلول. ونقوم بذلك عن طريق تمرير محلول BSA بتركيز 1% مخفف في PBS. ونظرًا لأن هذه الرقاقات ستُستخدم في التحاليل الجينومية اللاحقة، فإن جميع المحاليل التي نستخدمها خالية من RNA.

عادةً، نقوم بغسل الجهاز بأربعة إلى خمسة أحجام من محلول BSA بتركيز 1%. وبعد ذلك، نضيف الجسم المضاد. الجسم المضاد المستخدم في هذه التجربة هو CD 66 B، وهي أجسام مضادة متخصصة للخلايا المحببة في الدم الكامل.

نستخدم تركيزاً يتراوح بين 10 إلى 25 µg/mL، ثم نقوم بحقن الأجسام المضادة. سنحقن 200 µL من الأجسام المضادة في كل جهاز، وذلك عن طريق إجراء عمليتي حقن سعة كل منهما 100 µL، واحدة في كل منفذ من منافذ الجهاز.

عادةً ما نقوم بحقن 100 µL في أحد المنافذ، ثم ننتظر لمدة 30 دقيقة ونحقن 100 µL إضافية في المنفذ المقابل.