التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

العام للتجربة التالية هو التنبؤ باستخدام المستقبلات المشتركة لفيروس نقص المناعة البشرية واحد لإعطاء فئة جديدة من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الأحماض النووية الجينومية الفيروسية أو الحمض النووي الريبي الفيروسي أو الحمض النووي الفيروسي من دم المريض بعد تضخيم منطقة الغلاف. يتم تضخيم المنطقة الفيروسية V الثلاثة ، وهي المحدد الرئيسي للاستحاء ، عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل.

بعد ذلك ، يتم تسلسل V three amplicon مع بادئات مختلفة من أجل إنشاء ملف fasta. يتم الحصول على النتائج التي تظهر الانتحاء الفيروسي وقابلية المضاد للمستقبلات الأساسية بناء على المعدل الإيجابي الخاطئ أو FPR كما تم الحصول عليه بواسطة أداة التفسير عبر الإنترنت geno to pheno coreceptor. اعتمادا على استخدام CORECEPTOR ، تصنف فيروسات فيروس نقص المناعة البشرية على أنها R خمسة أو X أربعة.

ترتبط صخور ميري من خلال مستقبلات CCR الخمسة ، مما يمنع دخول الفيروسات R الخمسة في الخلية المستهدفة. خلال مسار المرض X ، قد تظهر أربعة فيروسات وتتفوق على الفيروسات R الخمسة. وبالتالي فإن إنهاء استخدام المستقبلات يسمى أيضا الانتحاء ، وهو إلزامي قبل إعطاء المرافيروك كما هو مطلوب من قبل EMA و FDA.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يحدد تحديدا موازيا لمقاومة فئات الأدوية الأخرى المضادة للفيروسات القهقرية بسهولة بالغة. تسمح هذه الطريقة بطب أكثر تخصيصا حيث يمكن تعديل قطع نتائج الانتحاء وفقا لاحتياجات المريض. كانت لدينا فكرة هذه الطريقة لأول مرة في بداية التسعينيات عندما أردنا معرفة الأساس الجزيئي لنمو ثقافة الخلايا المختلفة لسلالات فيروس نقص المناعة البشرية وتطور المرض لدى المرضى الذين يظهرون الإجراء سيكون بيانات فني من مجموعتنا قبل بدء هذا البروتوكول.

يتم جمع العينات على شكل دم EDTA في الموقع السريري وإرسالها إلى المختبر لبدء عزل الأحماض النووية لفيروس نقص المناعة البشرية من 1000 ميكرولتر من مصل الدم الكامل أو البلازما باستخدام نظام mag Pure Compact ومجموعة عزل الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم يتم التلميح إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المكتسب في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. تتمثل الخطوة التالية في تضخيم منطقة غلاف الحمض النووي عن طريق النسخ العكسي PCR للحمض النووي الريبي أو ببساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي كما هو موضح في النص ، يجب أن يولد التفاعل منتجا طويلا 1 ، 245 زوجا أساسيا يشتمل على غالبية منطقة بروتين الغلاف لتضخيم المنطقة الثلاثة V من بروتين المغلف الذي يتبع مع تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل باستخدام خمسة ميكرولترات من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول كقالب.

قم بإعداد التفاعلات باستخدام المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الداخلي المتداخل كما هو موضح في النص. يتم أيضا توضيح معلمات تشغيل PCR المتداخلة هناك. بعد تضخيم المنطقة الثلاثة V ، قم بتحليل منتج PCR للتحقق من المنتج المتوقع بطول 902 زوج أساسي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام قبل التسلسل.

قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بمجرد تنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء تفاعل التسلسل كما هو موضح في النص عند الانتهاء من التفاعل. قم بتنقية عينات التسلسل باستخدام cidex G 50 superfine ، ولوحة ترشيح متعددة الشاشات مع غشاء durapore باتباع التعليمات الواردة في الجزء المكتوب من هذا الإجراء لتسلسل المنتج المنقى ، وإعداد جهاز التسلسل عن طريق فحص البوليمر وتغيير المخزن المؤقت.

ثم قم بتحميل العينات وتعيين الشروط وبدء التشغيل. بعد تشغيل التسلسل. يمكن استخدام برنامج الجينات ليزر DNA STAR لمحاذاة التسلسلات وتحريرها.

يتم تسلسل ال V ثلاثة أمبليكون مع واحد على الأقل إلى الأمام وواحد خلفية التمهيدية. يقوم جين الليزر بمحاذاة ملفات ABI التي تم الحصول عليها من جهاز التسلسل مع التسلسلات المرجعية. V ثلاثة ، ينشئ الإجماع B وجين ليزر المغلف تسلسلا إجماعيا للعينة التي تم تحليلها باستخدام جميع البيانات الأولية المتاحة ، ولكن ليس المراجع ويخزنها كملف FASTA.

ملف FASTA هو ملف نصي يتضمن رأسا باسم العينة وتسلسل النيوكليوتيدات. لبدء تفسير البيانات والتنبؤ بالانتحاء ، قم بتحميل ملف FASTA في نظام الترجمة الفورية المستند إلى الويب. حدد المستقبل المشترك Geno Tono قطع FPR الذي يصنف الفيروس على أنه R خمسة.

باستخدام الإرشادات الألمانية ، يصنف الفيروس على أنه R خمسة. عندما يكون FPR أكبر من أو يساوي 20٪ و X أربعة ، عندما يكون FPR أقل من 12.5٪ حدد أي معلمات سريرية إضافية إذا كانت متوفرة ، ثم حدد ومحاذاة والتنبؤ هذا الخادم يترجم تسلسل النيوكليوتيدات إلى أحماض أمينية ، ويقوم بمحاذاته مع تسلسل V ثلاثة إجماع B ، وينتج تصنيفا فرعيا. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يولد تنبؤا باستخدام المستقبلات المشتركة معبرا عنه ك FPR.

يظهر الإخراج تفسيرا متدرجا اعتمادا على احتمالية استخدام المستقبلات المشتركة. بالنسبة لقيم FPR العالية ، يكون المرء متأكدا تماما من أن الفيروس ليس X أربعة وبالنسبة ل FPR المنخفض ، فإن المرء غير متأكد من شكل الفيروس إذا كان التفسير والنص ولون الخلفية أخضر. يشار إلى الإدارة الآمنة لصخرة رافي ، بينما يشير اللون الأصفر إلى احتمال انخفاض المخاطر لاستخدام صخرة رافي ، ويشير اللون الأحمر إلى أنه لا ينبغي وصف صخرة رافي.

بالإضافة إلى ذلك ، يقوم الخادم بإنشاء تقرير PDF يمكن طباعته وإرساله إلى الطبيب. يمكن تضمين بيانات إضافية مثل اسم المريض أو تاريخ استخراج الدم يدويا باستخدام برنامج كاتب PDF. في خصوصية جهاز الكمبيوتر الخاص بالمستخدم ، يمكن أيضا إضافة تعليقات محددة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد القطع الفيروسية باستخدام أداة مستقبلات جينو فينو أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إجراء ضوابط الجودة بانتظام. لا تنس أن العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذلك يجب دائما استخدام الاحتياطات والمختبرات البيولوجية الآمنة المعتمدة.