التنبؤ الإشتخدام HIV-1 Coreceptor (Tropism) من خلال تحليل تسلسل الوراثي باستخدام نهج

الهدف العام من التجربة التالية هو التنبؤ باستخدام المستقبل المشترك لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1) من أجل إعطاء فئة جديدة من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية. ويتم تحقيق ذلك من خلال عزل الأحماض النووية الجينومية الفيروسية، سواء كانت RNA الفيروسي أو DNA الفيروسي المدمج (proviral DNA)، من دم المريض بعد تضخيم منطقة الغلاف. يتم تضخيم المنطقة V3 الفيروسية، والتي تعد المحدد الرئيسي للميل النسيجي (tropism)، عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR).

بعد ذلك، يتم تسلسل قطعة تضخيم V3 باستخدام بادئات مختلفة من أجل إنشاء ملف fasta. وتُستخلص النتائج التي توضح الانتحاء الفيروسي والحساسية لمضادات المستقبلات المشتركة بناءً على معدل الإيجابية الكاذبة أو FPR كما تم الحصول عليه بواسطة أداة التفسير عبر الإنترنت geno to pheno coreceptor. وبناءً على استخدام CORECEPTOR، يتم تصنيف فيروسات HIV على أنها R5 أو X4.

يرتبط عقار maraviroc بمستقبل CCR5، مما يثبط دخول فيروسات R5 إلى الخلية المستهدفة. وخلال مسار المرض، قد تظهر فيروسات X4 وتنمو بشكل أكبر من فيروسات R5. لذا، فإن تحديد مدى استخدام المستقبل، وهو ما يسمى بالتوجّه النسيجي (tropism)، يعد أمراً إلزامياً قبل إعطاء عقار maraviroc وفقاً لمتطلبات EMA و FDA.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إجراء تقدير متوازٍ للمقاومة تجاه فئات أخرى من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية بكل سهولة. وتسمح هذه الطريقة بتطبيق طب شخصي بشكل أكبر، حيث يمكن تعديل نقاط القطع لنتائج الانتحاء (tropism) وفقاً لاحتياجات المريض. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة في بداية التسعينيات عندما أردنا معرفة الأساس الجزيئي لاختلاف نمو مزارع الخلايا لسلالات HIV وتطور المرض لدى المرضى، وسيقوم فني من مجموعتنا بتوضيح الإجراء قبل البدء في هذا البروتوكول.

يتم جمع العينات على شكل دم EDTA في الموقع السريري وإرسالها إلى المختبر لبدء عزل الأحماض النووية لـ HIV من 1000 µL من مصل الدم الكامل أو البلازما باستخدام نظام mag pure compact وطقم عزل الأحماض النووية وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، يتم إذابة الـ RNA أو الـ DNA المستخلص في 50 µL من منظم TE. الخطوة التالية هي تضخيم منطقة الغلاف للحمض النووي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (reverse transcription PCR) للـ RNA أو ببساطة PCR للـ DNA كما هو موضح في النص؛ ويجب أن ينتج عن التفاعل ناتج بطول 1,245 base pair يشمل غالبية منطقة بروتين الغلاف. ولتضخيم منطقة V3 من بروتين الغلاف، يتم إجراء PCR متداخل (nested PCR) باستخدام 5 µL من تفاعل الـ PCR الأول كقالب.

قم بتحضير التفاعلات باستخدام المزيج الرئيسي (master mix) لتفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) المُعد داخلياً كما هو موضح في النص. كما تم تحديد معايير تشغيل تفاعل الـ Nested PCR هناك أيضاً. بعد تضخيم منطقة V3، قم بتحليل ناتج تفاعل الـ PCR للتحقق من وجود المنتج المتوقع بطول 902 base pair عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (gel electrophoresis) قبل البدء في عملية التسلسل.

قم بتنقية ناتج PCR كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. وبمجرد تنقية ناتج PCR، قم بإجراء تفاعل التسلسل كما هو مبين في النص عند اكتمال التفاعل. قم بتنقية عينات التسلسل باستخدام cidex G 50 superfine، ولوحة ترشيح متعددة الشاشات ذات غشاء durapore باتباع التعليمات الواردة في الجزء المكتوب من هذا الإجراء؛ ولتسلسل المنتج المنقى، قم بتجهيز جهاز التسلسل عن طريق فحص البوليمر وتغيير المحلول المنظم.

بعد ذلك، قم بتحميل العينات، وتحديد الظروف، وبدء عملية التشغيل. وعقب انتهاء عملية التسلسل، يمكن استخدام برنامج DNA STAR laser gene لمحاذاة التسلسلات وتحريرها.

يتم تسلسل مضخم V3 باستخدام بادئ أمامي واحد وبادئ عكسي واحد على الأقل. يقوم برنامج Lasergene بمحاذاة ملفات ABI التي تم الحصول عليها من جهاز التسلسل مع التسلسلات المرجعية. يقوم Lasergene، من خلال V3 وconsensus B وenvelope، بإنشاء تسلسل إجماعي للعينة التي تم تحليلها باستخدام جميع البيانات الخام المتاحة، دون استخدام المراجع، ويقوم بتخزينه كملف FASTA.

ملف FASTA هو ملف نصي يتضمن ترويسة تحتوي على اسم العينة وتسلسل النيوكليوتيدات. لبدء تفسير البيانات والتنبؤ بالانتحاء، قم بتحميل ملف FASTA في نظام التفسير القائم على الويب. في Geno Tono co-receptor، حدد قيمة القطع FPR التي يتم بناءً عليها تصنيف الفيروس على أنه R five.

باستخدام الإرشادات الألمانية، يتم تصنيف الفيروس على أنه R five عندما يكون FPR أكبر من أو يساوي 20%، وكـ X four عندما يكون FPR أقل من 12.5%. اختر أي معاملات سريرية إضافية إذا كانت متاحة، ثم اختر align and predict. يقوم هذا الخادم بترجمة تسلسل النيوكليوتيدات إلى أحماض أمينية، ويقوم بمحاذاتها مع تسلسل V three consensus B، وينتج تصنيفاً للنمط الفرعي. بالإضافة إلى ذلك، يقوم بإنشاء تنبؤ باستخدام المستقبل المشترك والذي يتم التعبير عنه كـ FPR.

تظهر النتيجة تفسيراً متدرجاً يعتمد على احتمالية استخدام المستقبل المساعد. بالنسبة لقيم FPR العالية، يكون المرء واثقاً تماماً من أن الفيروس ليس X four، أما بالنسبة لقيم FPR المنخفضة، فيكون المرء غير متأكد من طبيعة الفيروس إذا كان نص التفسير ولون الخلفية باللون الأخضر. يشير اللون الأخضر إلى إمكانية الإعطاء الآمن لعقار Ravi Rock، بينما يشير اللون الأصفر إلى احتمال وجود مخاطر منخفضة عند استخدام Ravi Rock، ويشير اللون الأحمر إلى أنه لا ينبغي وصف Ravi Rock.

بالإضافة إلى ذلك، يقوم الخادم بإنشاء تقرير بصيغة PDF يمكن طباعته وإرساله إلى الطبيب. ويمكن إدراج بيانات إضافية يدوياً، مثل اسم المريض أو تاريخ سحب الدم، باستخدام برنامج لتحرير ملفات PDF. كما يمكن إضافة تعليقات محددة بخصوصية تامة على جهاز الكمبيوتر الخاص بالمستخدم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد القصاصات الفيروسية باستخدام أداة geno pheno receptor. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إجراء ضوابط الجودة بانتظام. ولا تنسَ أن العمل مع HIV يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة والعمل في مختبرات ذات مستوى أمان بيولوجي معتمد.