كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج فيروسات بارفو معاد تركيبها، أو rec PVS بعيارات عالية مع الحفاظ على جودتها وتقليل أوقات وتكاليف الإنتاج. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنتاج مخزون فيروسي أولي من rec PV من خلال ترنسفكشن خلايا HEC 2 93 T باستخدام بلازميدات rec PV، جنباً إلى جنب مع ناقل مشتق من الفيروس الغدي من النوع الخامس. وذلك لأن إدخال العناصر الجينية لـ ad في خلايا HEC 2 9 3 T يزيد من إنتاج rec PVS بأكثر من عشرة أضعاف.

بالمقارنة مع البروتوكولات الموجودة، تم إنتاج مساعد AD VP جديد يحتوي على العناصر الجينومية للفيروس الغدي اللازمة لتعزيز إنتاج الفيروس الصغير المؤتلف، بالإضافة إلى وحدة جين VP للفيروس الصغير. الخطوة التالية هي إنتاج وتنقية مساعد ADD VP الجديد هذا وفقاً للبروتوكولات القياسية.

تتمثل الخطوة النهائية في هذا الإجراء في تضخيم rec PVS عن طريق الإصابة المشتركة لخلايا NB three 20 4K بفيروسي rec PV و AD ADP. وبفضل هذه الاستراتيجية، تتحسن كفاءة إنتاج rec PV بأكثر من 100 ضعف، ويمكن استخدام هذه الطريقة حصرياً بمجرد إنتاج كمية صغيرة من rec PVS عبر عملية عفن الخلية (transfection). وفي النهاية، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR) أو مقايسة التنحي (transduction assay) لتقدير عيار المخزونات الفيروسية المنتجة.

بالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء مقايسة اللويحات (plaque assay) للتأكد من عدم تولد فيروسات غير مرغوب فيها قادرة على التضاعف أثناء عملية الإنتاج. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الإنتاج التقليدي للفيروسات الغدية المعاد تركيبها عبر البلازميد في الخلايا النشطة والمعالجة، في أنه بمجرد إنتاج المخزونات الأولية من الفيروسات الغدية المعاد تركيبها باستخدام مساعد adenovirus VP، سيعتمد إنتاجنا كلياً على العدوى الفيروسية. وهذا يسمح باستخدام خلايا NBK، والتي تعد منتجات جيدة للفيروسات الغدية، ولكنها غير قابلة للترصيف (transfect).

بهذه الطريقة، يمكن تضخيم الفيروسات المؤشبة وزيادة القوة الشائعة للفيروسات التي تعالج بأكثر من 100 ضعف، مما يقلل من وقت وتكلفة الإنتاج. ستقوم باربرا لويك، رئيسة وحدة إنتاج الفيروسات التي طورت معنا هذا البروتوكول الجديد، باستعراض هذا الإجراء. نأمل أن ينال هذا الفيديو إعجابكم ونتمنى لكم حظاً موفقاً في تجاربكم.

يعد إنتاج فيروس بارفو المؤتلف (recombinant parvovirus) أو rec PV عن طريق ترانسفكشن (transfection) ضرورياً لإنتاج الحد الأدنى من rec PVS ليعمل كلقاح في عملية إنتاج rec PVS اللاحقة عن طريق العدوى. يتطلب إنتاج rec PVS مختبراً من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية قبل يوم واحد من عملية الترانسفكشن. يتم استزراع 2 million من خلايا HEC 2 9 3 T في طبق بقطر 10 centimeter للحصول على تغطية خلوية بنسبة 50%.

في يوم عفن الخلايا (transfection)، قم بتنمية الخلايا في 10 milliliters من وسط DMEM المكمل بـ 10%FBS وL-glutamine والبنسلين والستربتومايسين، ثم حضنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5%carbon dioxide ورطوبة بنسبة 92%. وفي يوم عفن الخلايا، قم بتحضير خليط تصنيع الفيروس في أنبوب سعة 1.5 milliliter. أضف الكواشف التالية بنسبة مولارية قدرها واحد إلى اثنين إلى واحد: ثلاثة ميكروجرامات من ناقل rec PV الذي يحمل الجين المنقول المطلوب.

ستة ميكروجرام من الناقل P-C-M-V-V-P الذي يحمل وحدة جين كبسيدة الفيروس الغدي (parvovirus)، وثمانية ميكروجرام من البلازميد المساعد المشتق من الفيروس الغدي. خفف خليط البلازميد باستخدام وسط خالٍ من المصل حتى 850 ميكرولتر للحصول على تركيز نهائي قدره 20 نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك، أضف 42.5 ميكرولتر من كاشف ترانسفكشن FU gene HD بنسبة 2.5 إلى 1 من كاشف FU gene إلى DNA.

احرص على عدم ملامسة كاشف جين FU لجدار الأنبوب، وقم بالرج الدوامي بلطف لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ، ثم حضّن خليط عفن الخلية (transfection mixture) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف خليط عفن الخلية إلى الخلايا قطرة تلو الأخرى. رجّ الطبق بلطف لتوزيع الخليط بشكل متساوٍ.

تُحضن الصفيحة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون و92% من الرطوبة. خلال هذه الفترة، تتشكل جسيمات parvovirus الوليدة من بلازميدات parvovirus لحصاد الفيروس. أولاً، يتم كشط الخلايا مع وسطها الغذائي، ثم يتم شفط المعلق ونقله من الصفيحة إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 250 G لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، أزل 95% من السائل الطافي، مع ترك حوالي 0.5 milliliters. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتيكس (Vortex) بلطف لإعادة تعليق الراسب في السائل الطافي المتبقي، ثم انقله إلى أنبوب إبندورف (Eppendorf tube) سعة 1.5 milliliter.

قم بتجميد المعلق في حمام من النيتروجين السائل، ثم قم بإذابته في ماء دافئ عند 37 °C. قم برج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز Vortex لمدة 15 ثانية. كرر دورة التجميد والإذابة مرتين إضافيتين.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 16,000 G لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم اجمع السائل الطافي في أنبوب جديد. يحتوي السائل الطافي في هذه المرحلة على مستخلص الفيروس الخام، والذي يمكن استخدامه كلقاح لإنتاج rec PVS عن طريق العدوى. Power virus gain.

تعتمد عمليات التضاعف على عوامل خلوية يتم التعبير عنها في الخلايا المتكاثرة. لذلك، من المهم أن تكون الخلايا المستخدمة لإنتاج الفيروس المؤتلف في حالة مثالية ومزروعة بكثافة مناسبة كما هو موضح في هذا البروتوكول. قبل يوم واحد من العدوى، يتم زراعة 10 million من خلايا MB three 20 4K في قارورة T 1 75 للحصول على درجة تلاقي خلوي تتراوح بين 60 إلى 80% في اليوم التالي.

قم بتجهيز دورق ثانٍ يحتوي على نفس عدد الخلايا ليكون بمثابة عينة ضابطة. يجب أن يحتوي كل دورق T 1 75 على 20 milliliters من MEM كحجم نهائي، مع إضافة 5%FBS وL-glutamine والبنسلين والستربتومايسين في صباح يوم العدوى. قم بتحضير خليط فيروسي في أنبوب بلاستيكي سعة two milliliters.

أضف هذه الكواشف. أضف المساعد VP. أضف تعدد عدوى مقداره 10 من rec PVS عند MOI قدره 0.5 وMEM إلى 1.5 milliliters.

أضف خليط الفيروس بالكامل إلى إحدى دوارق T 1 75. قم بحضن الدورق لمدة ساعتين عند 37 °C، ورطوبة 92%، و5% carbon dioxide مع الرج اللطيف كل 15 دقيقة. استمر في الحضن لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة إضافية عند 37 °C، ورطوبة 92%، و5% carbon dioxide.

بعد مرور 20 إلى 24 ساعة، استبدل الوسط الزرعي بوسط جديد، وحضن القارورة تحت نفس الظروف لمدة 48 ساعة لضمان الإنتاج الفعال للفيروس. يجب ملاحظة علامات واضحة على السُميّة الخلوية في القارورة التي تحتوي على الخلايا المصابة بالفيروس. بدءاً من 36 إلى 48 ساعة بعد العدوى وبعد مرور 48 ساعة، اشفط وانقل السائل الطافي للوسط من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1.5 milliliters من PBS، ثم استخدم trypsin لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق، وبعد ذلك أضف معلق الخلايا إلى الوسط الذي تمت إزالته. قم بإجراء عملية طرد مركزي للخلايا والرائق عند 5,000 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من الرائق وأضف 1 milliliter من TE buffer إلى كتلة الخلايا. قم برج الأنبوب بلطف باستخدام جهاز vortex لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك، جمد معلق الخلايا في حمام من النيتروجين السائل، ثم قم بإذابته في ماء دافئ عند 37 °C.

قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المرج (Vortex) بقوة لمدة 15 ثانية. كرر دورة التجميد والإذابة ثلاث مرات. بعد ذلك، قم بمعالجة معلق الخلايا باستخدام Ben Nase nuclease لمدة 30 دقيقة عند 37 °C من أجل هضم الحمض النووي الجينومي للخلايا والحمض النووي الفيروسي غير المغلف.

بعد مرور 30 دقيقة، يتم طرد الأنبوب مركزياً بسرعة 5,000 G لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وأخيراً، يتم جمع السائل الطافي في أنبوب جديد. يحتوي السائل الطافي في هذه المرحلة على مستخلص فيروسي خام.

يجب أن تكون الإنتاجيات النموذجية من rec PV GFP التي تم إنتاجها وفقاً لهذا البروتوكول في نطاق من مرة واحدة إلى 10 مضروبة في 10 أس 8 وحدات فيروسية معدية. يظهر هنا مثال على تحفيز إنتاج rec PV بواسطة بلازميد قائم على الأدينو فيروس. مستخلصات فيروسية خام تحتوي على PHH one GFP erect PV التي تحمل جين GFP أو لا تحمله.

تم تطبيق بلازميد PXX القائم على الفيروس الغداني على خلايا NBK الكاشفة؛ وكما يظهر في هذه الصور المجهرية، هناك المزيد من الخلايا الموجبة لـ GFP في وجود PXX six. وعند إجراء اختبارات نقل GFP، تم الحصول على زيادة واضحة في إنتاج rec PV في وجود Pxx six. حيث ارتفع الإنتاج من 0.3 وحدات نقل GFP أو TU لكل خلية، والتي تم الحصول عليها بواسطة البروتوكولات التقليدية، إلى ما يقرب من خمس TU لكل خلية تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول.

تشير نتائج مقايسة ترانسدكشن GFP إلى أن جينات الفيروس الغدي E2a و E4 و VA RNA الموجودة في PXX6 قادرة على تعزيز إنتاج الفيروسات الصغيرة (parvovirus). يوضح الشكل التالي مثالاً تمثيلياً لإنتاج PV المؤتلف عبر العدوى. حيث تم إصابة خلايا NB3 20 4K بفيروس المساعدة ADP المنقى، ثم أُجريت لها عدوى فائقة باستخدام أحد فيروسين صغيرين مؤتلفين.

استُخدمت مستخلصات خلوية خام لتحديد عيارات الفيروس من خلال مقايسة نقل جيني، والتي أظهرت أن المساعد AD VP قد عزز بشكل أكبر إنتاج rec PV ليصل إلى أكثر من 70 T لكل خلية. وأخيراً، تم تحليل الدفعات الفيروسية التي أُنتجت في وجود أو غياب ADP لتحديد محتواها من الجسيمات الفيروسية القادرة على التضاعف عن طريق مقايسة اللويحات على خلايا المؤشر MB three 20 4K. وتشير النتائج إلى أن المساعد ADP قد عزز إنتاج rec PV دون زيادة حدوث الجسيمات الفيروسية غير المرغوب فيها القادرة على التضاعف بعد تطويرها.

تتيح هذه التقنية للعلماء في مجال علاج السرطان والعلاج الجيني زيادة نطاق إنتاج الفيروسات القوية المؤتلفة. وباستخدام المفاعلات الحيوية، يمكن إنتاج متغيرات بكميات كبيرة كما هو مطلوب في الإعدادات السريرية.