رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات Aplysia
يوليو 15, 2012
نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة Aplysia. نحن صورة الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام صبغة الفلورسنت، أورانج الكالسيوم، وحمل ومراقبة انتقال متشابك مع الأقطاب الكهربائية (داخل الخلايا) حادة.
تم تضمين الكالسيوم داخل الخلايا كجزء مهم من العديد من آليات اللدونة المشبكي. يمكن اختبار هذه الأفكار من خلال مراقبة التغيرات في الكالسيوم والتغيرات في فعالية التشابك في نفس الوقت. نوضح هنا كيف يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين تصوير الكالسيوم والتسجيل داخل الخلايا.
يتم إجراء تجاربنا مع عقدة من الرخويات Aplysia Cahora. يحتوي هذا المستحضر على عدد من المزايا مثل الخلايا العصبية الكبيرة المحددة ، ودرجات الحرارة المنخفضة الطبيعية للأبيا ، والإشارات البطيئة وتسهيل التصوير ، ولكن التقنيات العامة التي نعرضها يتم نقلها بسهولة إلى أنظمة أخرى. مرحبا ، أنا كولين إيفانز في مختبر إليزابيث كروبر في قسم علم الأعصاب في فيشبورغ ومعهد فريدمان للدماغ في كلية ماونت سيناي للطب في مدينة نيويورك.
اليوم ، سنعرض التصوير المتزامن للتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا والفعالية المشبكية في العقدة الشدقية للرخويات Aplysia cahora. للكشف عن الكالسيوم داخل الخلايا ، سنقوم بحقن خلية عصبية ما قبل التشابك مع صبغة مؤشر الكالسيوم IMP الدائم بالكالسيوم البرتقالي. ثم يتم نقل المستحضر تحت المجهر ويتم وخوزة الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي بأقطاب كهربائية حادة.
ينتج عن التحفيز المتكرر قبل المشبكي استجابة معززة لما بعد المشبكي مرئية على أنها زيادة إمكانات ما بعد المشبكي أو سعة PSP. سيسمح لنا قياس إشارة الفلورسنت لصبغة مؤشر الكالسيوم باكتشاف التغيرات المتزامنة في الكالسيوم داخل الخلايا قبل المشبكي. لبدء تخدير بالغ يزن حوالي 150 جراما عن طريق حقن 75 مل من محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر ، قم بتثبيت المخدر في طبق مغطى بالشمع ، ثم باستخدام ملقط ومقص إجمالي ، وقم بعمل شق في قدم وفضح الكتلة الشدقية.
تقع العقدة الشدقية على الجانب البطني من الكتلة الشدقية وتتكون من عقدتين نصيبتين متصلتين. يحتوي على عدة مئات من الخلايا العصبية التي تساهم مع الخلايا العصبية في العقد الأخرى في توليد سلوك تغذية والتحكم فيه. حرر العقدة بعناية عن طريق قطع جميع الأعصاب الملتوية بمقص ناعم وإزالتها من.
ثم قم بتثبيت العقدة المحررة على قاعدة طبق مطلي بواقي السيل مملوء بمياه البحر الاصطناعية. يتم لف العقدة في غمد من النسيج الضام ، والذي يجب إزالته لفضح الخلايا العصبية الفردية. استخدم ملقط التحقق ومقص القزحية والعناية الفائقة لقطع هذا الغمد.
لتجنب إتلاف الخلايا العصبية ، قم بتثبيت العقدة de sheath مع دبابيس حوالي 15 دقيقة لأن أي حركة ستكون مشكلة أثناء التصوير. لتحضير أقطاب كهربائية حادة للتسجيل داخل الخلايا وحقن الصبغة ، اسحب الأنابيب الشعرية باستخدام مجتذب قطب كهربائي صغير. نستخدم زجاج سيليكات الأفعى الرقيق ذو الجدران بقطر خارجي يبلغ ملليمتر واحد.
يجب أن يكون لأقطاب التسجيل مقاومة تبلغ حوالي 10 ميجا عند ملؤها بثلاثة أسيتات بوتاسيوم مولارية ، ولذلك نقوم بضبط المجتذب وفقا لذلك لملء الأقطاب الكهربائية D. اغمس الجزء الخلفي من القطب المسحوب في محلول 10 مللي مولار من عمل الشعيرات الدموية لصبغة الكالسيوم البرتقالية على طول الفتيل الزجاجي داخل القطب الكهربائي سيسحب الصبغة إلى الطرف ، ثم قم بإعادة ملء القطب الكهربائي بكلوريد البوتاسيوم 200 ملليمولار لضمان التلامس الكهربائي الجيد. نحن نستخدم بيلا مصممة خصيصا لتحسين خصائص القطب الكهربائي وخفض مقاومة القطب الكهربائي إلى حوالي خمسة ميغا.
يتم تثبيت القطب الكهربائي بزاوية 45 درجة في تيار من تعليق أكسيد الألومنيوم. يسمح خلط كلوريد الصوديوم في المعلق وتوصيل مقياس آخر بمراقبة مقاومة القطب. أثناء عملية الشطف ، نقوم بنقل الطبق الذي يحتوي على العقد المشبك المخادعة إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية وتحديد موقع الخلايا العصبية ذات الأهمية عن طريق خداعها بأقطاب كهربائية والتحقق من هويتها.
لتحضير الخلايا العصبية لتصوير الكالسيوم ، نقوم أولا بإدخال قطب كهربائي مملوء بالصبغة في سوما الخلية ونقوم بتحميل الصبغة الكهربائية نظريا مع 30 دقيقة من فرط الاستقطاب ، 15 نبضات تيار نانو أمبير. عندما يدخل برتقالي الكالسيوم D إلى الخلية ، سيكتسب SOR لونا ورديا باهتا. ثم نقوم بسحب أقطاب التسجيل بعناية ونترك المستحضر جالسا لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للصبغة بالانتشار في العمليات الدقيقة للخلايا العصبية.
بعد ذلك ، انقل الطبق مع التحضير إلى مجهر الفلورسنت. نستخدم عدسة غمر الماء 10 مرات NA 0.3 على مجهر مستقيم ثابت ، والذي يركز عن طريق تحريك العدسة وليس المسرح. هذا يجعل من السهل تركيب المتلاعبين.
بالنسبة لأقطاب التسجيل، حدد كتلة مرشح مناسبة. ستوفر كتلة المرشحات الثلاثة SI مرشحات الإثارة والانبعاث الصحيحة لبرتقالي الكالسيوم ، وضبط معلمات الكاميرا وشدة الإضاءة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة وفتحة المجال. سيؤدي المزيد من الضوء إلى ضوضاء أقل ، ولكن من المحتمل أن يبيض المستحضر.
يمكن لكاميرا CCD المفاجئة الرائعة التقاط مجال 500 × 300 بكسل بمعدل إطارات يبلغ حوالي 30 إطارا في الثانية ، ونسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء. قلل من إضاءة الخلايا العصبية fil عن طريق إبقاء مصراع مصادر الضوء مغلقا كلما أمكن ذلك. في برنامج التصوير، حدد مناطق الاهتمام أو R ois.
تحدد هذه المناطق المكان الذي سيأخذ فيه البرنامج قياسات الشدة. نصور بشكل عام الفروع الأولية والثانوية والثالثية للخلايا العصبية قبل المشبكي. ضع عائد استثمار إضافي بجوار الخلايا العصبية الثنائية للحصول على قيمة خلفية يتم طرحها لاحقا من جميع نقاط البيانات الأخرى.
تستخدم أقطاب التسجيل داخل الخلايا في الخلايا العصبية قبل وبعد التشابك للحث على ومراقبة الإرسال المتشابك. يمكنك ضمان التزامن بين الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير إذا كنت تستخدم إشارة تشغيل إطار الكاميرا لبدء تشغيل برنامج الحصول على البيانات. هناك طريقة أخرى لضمان المزامنة وهي تركيب مؤشر LED داخل منفذ الكاميرا.
يتم تشغيل مؤشر LED هذا لفترة وجيزة في بداية جلسة التسجيل ، وبالتالي يوفر علامة التزامن. أثناء تجربة نموذجية ، تقوم بتشغيل إمكانات الفعل في الخلايا العصبية قبل المشبكية عن طريق حقن نبضات تيار قصيرة. في هذا المثال ، نعرض موجة من المسامير والزيادات المقابلة في إشارة الكالسيوم لاختبار فرضيات محددة.
يمكن التلاعب بإشارة الكالسيوم وتحديد التأثيرات على الإرسال المتشابك. على سبيل المثال ، يمكن حقن أدوية مثل مخلب الكالسيوم EGTA قبل المشبكي أو تطبيقها من خلال نظام التروية. يتم تحليل البيانات عن طريق تصديرها من برنامج التصوير إلى ملف نصي ثم إلى البرنامج الذي تم استخدامه للحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية ، والتي في حالتنا هي الارتفاع الثاني بواسطة Cambridge Electronic Design.
نستخدم نصا مكتوبا مخصصا لرسم قيم شدة عائد الاستثمار والتغيرات المقابلة في إمكانات الغشاء لتحديد التغيرات في إشارة الكالسيوم عن طريق طرح إشارة الخلفية التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار في الخلفية وحساب التغيير النسبي مع المعادلة المعروضة. F صفر هو التألق قبل التحفيز مباشرة ، و F هو التألق أثناء التحفيز. نعرض هنا نتائج تجربة قمنا فيها بتصوير التغيرات في مضان الكالسيوم في الخلايا العصبية B 21 المحددة.
يشار إلى المنطقة التي صورناها في A ، في B واحد ، أحدثنا انفجارا من المسامير في B 21 ، مما أدى إلى إمكانات ما بعد المشبكي في B ثمانية وتغيير في إشارة الكالسيوم. يظهر B الثاني تأثير حقن مخلب الكالسيوم. لم تعد طفرات EGTA في B 21 تحفز زيادات واسعة النطاق في مضان الكالسيوم وتقل سعة إمكانات ما بعد التشابك.
في الختام ، أظهرنا تقنيات يمكن استخدامها لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد وتقييم فعالية انتقال الشبكي. تتطلب هذه التقنيات معدات متواضعة فقط مقارنة بمعظم التصوير الوظيفي وهي سهلة وسريعة التعلم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة المراقبة المتزامنة لتركيز الكالسيوم الحر داخل الخلايا وفعالية المشابك في مستحضر العقدة العصبية من Aplysia. باستخدام الكالسيوم البرتقالي للتصوير والأقطاب الكهربائية داخل الخلايا الحادة لنقل المشابك، يسلط البحث الضوء على العلاقة بين ديناميكيات الكالسيوم واللدونة المشبكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- اللدونة المشبكية
- تصوير الكالسيوم
الخلفية
- يلعب الكالسيوم داخل الخلايا دورًا حاسمًا في آليات اللدونة المشبكية.
- يمكن أن يوفر المراقبة المتزامنة للكالسيوم والفعالية المشبكية رؤى حول هذه الآليات.
- يوفر مستحضر العقدة العصبية من Aplysia مزايا لمثل هذه الدراسات.
- يمكن تكييف التقنيات الموضحة لأنظمة أخرى.
هدف الدراسة
- للتحقيق في دور الكالسيوم داخل الخلايا في نقل المشابك.
- لإظهار طريقة للمراقبة المتزامنة لتركيز الكالسيوم والفعالية المشبكية.
- لاستخدام Aplysia ككائن نموذجي لأبحاث علم الأعصاب.
الأساليب المستخدمة
- تصوير الكالسيوم باستخدام الصبغة الفلورية الكالسيوم البرتقالي.
- تسجيل داخل الخلايا باستخدام أقطاب حادة لمراقبة نقل المشابك.
- جرت التجارب على عقدة من الرخويات Aplysia.
- استخدام الخلايا العصبية المحددة الكبيرة لتصوير فعال.
النتائج الرئيسية
- المراقبة المتزامنة الناجحة لتركيز الكالسيوم والفعالية المشبكية.
- أظهرت العلاقة بين ديناميكيات الكالسيوم ونقل المشابك.
- أبرزت مزايا استخدام Aplysia لمثل هذه الدراسات.
- وفرت منهجية يمكن تطبيقها على النظم البيولوجية الأخرى.
الاستنتاجات
- الكالسيوم داخل الخلايا أساسي لفهم اللدونة المشبكية.
- تقنيات التصوير والتسجيل المدمجة فعالة لأبحاث علم الأعصاب.
- يعمل Aplysia كنموذج قيم لدراسة آليات المشابك.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic link between intracellular calcium dynamics and synaptic efficacy is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. This approach enables predictive confidence in pathway modulation by directly linking a key second messenger to functional synaptic output. The Aplysia ganglion model provides a disease-relevant system for probing conserved plasticity mechanisms with high signal-to-noise and experimental stability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether modulating intracellular calcium alters synaptic transmission in identified neurons.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of calcium flux and postsynaptic potential changes.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by establishing causal relationships between calcium signaling and synaptic efficacy.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with normal ion channel distribution and stable synaptic connections for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers ratiometric-free fluorescence intensity changes correlated with electrophysiological readouts for high-content analysis.
- Scalability: Uses long-wavelength dye Calcium Orange requiring no filter wheel, simplifying imaging setup and increasing throughput potential.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved synaptic plasticity mechanisms applicable to neuropsychiatric and neurodegenerative disorder targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanism probing with preclinical validation through standardized calcium-synaptic readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how target modulation affects both calcium dynamics and functional synaptic output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking target engagement (via calcium modulation) to functional phenotypic outcomes (synaptic efficacy), supporting lead identification and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about calcium-dependent signaling pathways in synaptic plasticity using direct perturbation and dual-readout measurement.
- Screening: Enables assay standardization through stable preparations, low phototoxicity dyes, and synchronized electrophysiology-imaging data collection.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ΔF/F fluorescence and PSP amplitude) that allow comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by correlating intracellular calcium changes with synaptic efficacy in a disease-relevant invertebrate model of conserved neural mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing calcium-dependent synaptic mechanisms across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in calcium-synapse relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dye loading, electrode preparation, and synchronization via LED trigger.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets implicated in synaptic dysfunction.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on dual-modality readouts of target engagement and functional effect.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intracellular sharp electrode recording and calcium imaging techniques.
- Depends on fluorescence microscopy capable of 30 fps imaging and electrophysiology rigs with LED synchronization.
- Necessitates cross-team standardization between imaging and electrophysiology teams for synchronized data acquisition.
- Involves adaptation considerations when transferring the Aplysia ganglion preparation to other model systems with different neuronal sizes or synaptic properties.
- Limited by the inability of Calcium Orange to provide absolute calcium concentrations due to non-ratiometric nature and dye diffusion variables.
