رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات Aplysia

تم تضمين الكالسيوم داخل الخلايا كجزء مهم من العديد من آليات اللدونة المشبكي. يمكن اختبار هذه الأفكار من خلال مراقبة التغيرات في الكالسيوم والتغيرات في فعالية التشابك في نفس الوقت. نوضح هنا كيف يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين تصوير الكالسيوم والتسجيل داخل الخلايا.

يتم إجراء تجاربنا مع عقدة من الرخويات Aplysia Cahora. يحتوي هذا المستحضر على عدد من المزايا مثل الخلايا العصبية الكبيرة المحددة ، ودرجات الحرارة المنخفضة الطبيعية للأبيا ، والإشارات البطيئة وتسهيل التصوير ، ولكن التقنيات العامة التي نعرضها يتم نقلها بسهولة إلى أنظمة أخرى. مرحبا ، أنا كولين إيفانز في مختبر إليزابيث كروبر في قسم علم الأعصاب في فيشبورغ ومعهد فريدمان للدماغ في كلية ماونت سيناي للطب في مدينة نيويورك.

اليوم ، سنعرض التصوير المتزامن للتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا والفعالية المشبكية في العقدة الشدقية للرخويات Aplysia cahora. للكشف عن الكالسيوم داخل الخلايا ، سنقوم بحقن خلية عصبية ما قبل التشابك مع صبغة مؤشر الكالسيوم IMP الدائم بالكالسيوم البرتقالي. ثم يتم نقل المستحضر تحت المجهر ويتم وخوزة الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي بأقطاب كهربائية حادة.

ينتج عن التحفيز المتكرر قبل المشبكي استجابة معززة لما بعد المشبكي مرئية على أنها زيادة إمكانات ما بعد المشبكي أو سعة PSP. سيسمح لنا قياس إشارة الفلورسنت لصبغة مؤشر الكالسيوم باكتشاف التغيرات المتزامنة في الكالسيوم داخل الخلايا قبل المشبكي. لبدء تخدير بالغ يزن حوالي 150 جراما عن طريق حقن 75 مل من محلول كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر ، قم بتثبيت المخدر في طبق مغطى بالشمع ، ثم باستخدام ملقط ومقص إجمالي ، وقم بعمل شق في قدم وفضح الكتلة الشدقية.

تقع العقدة الشدقية على الجانب البطني من الكتلة الشدقية وتتكون من عقدتين نصيبتين متصلتين. يحتوي على عدة مئات من الخلايا العصبية التي تساهم مع الخلايا العصبية في العقد الأخرى في توليد سلوك تغذية والتحكم فيه. حرر العقدة بعناية عن طريق قطع جميع الأعصاب الملتوية بمقص ناعم وإزالتها من.

ثم قم بتثبيت العقدة المحررة على قاعدة طبق مطلي بواقي السيل مملوء بمياه البحر الاصطناعية. يتم لف العقدة في غمد من النسيج الضام ، والذي يجب إزالته لفضح الخلايا العصبية الفردية. استخدم ملقط التحقق ومقص القزحية والعناية الفائقة لقطع هذا الغمد.

لتجنب إتلاف الخلايا العصبية ، قم بتثبيت العقدة de sheath مع دبابيس حوالي 15 دقيقة لأن أي حركة ستكون مشكلة أثناء التصوير. لتحضير أقطاب كهربائية حادة للتسجيل داخل الخلايا وحقن الصبغة ، اسحب الأنابيب الشعرية باستخدام مجتذب قطب كهربائي صغير. نستخدم زجاج سيليكات الأفعى الرقيق ذو الجدران بقطر خارجي يبلغ ملليمتر واحد.

يجب أن يكون لأقطاب التسجيل مقاومة تبلغ حوالي 10 ميجا عند ملؤها بثلاثة أسيتات بوتاسيوم مولارية ، ولذلك نقوم بضبط المجتذب وفقا لذلك لملء الأقطاب الكهربائية D. اغمس الجزء الخلفي من القطب المسحوب في محلول 10 مللي مولار من عمل الشعيرات الدموية لصبغة الكالسيوم البرتقالية على طول الفتيل الزجاجي داخل القطب الكهربائي سيسحب الصبغة إلى الطرف ، ثم قم بإعادة ملء القطب الكهربائي بكلوريد البوتاسيوم 200 ملليمولار لضمان التلامس الكهربائي الجيد. نحن نستخدم بيلا مصممة خصيصا لتحسين خصائص القطب الكهربائي وخفض مقاومة القطب الكهربائي إلى حوالي خمسة ميغا.

يتم تثبيت القطب الكهربائي بزاوية 45 درجة في تيار من تعليق أكسيد الألومنيوم. يسمح خلط كلوريد الصوديوم في المعلق وتوصيل مقياس آخر بمراقبة مقاومة القطب. أثناء عملية الشطف ، نقوم بنقل الطبق الذي يحتوي على العقد المشبك المخادعة إلى جهاز الفيزيولوجيا الكهربية وتحديد موقع الخلايا العصبية ذات الأهمية عن طريق خداعها بأقطاب كهربائية والتحقق من هويتها.

لتحضير الخلايا العصبية لتصوير الكالسيوم ، نقوم أولا بإدخال قطب كهربائي مملوء بالصبغة في سوما الخلية ونقوم بتحميل الصبغة الكهربائية نظريا مع 30 دقيقة من فرط الاستقطاب ، 15 نبضات تيار نانو أمبير. عندما يدخل برتقالي الكالسيوم D إلى الخلية ، سيكتسب SOR لونا ورديا باهتا. ثم نقوم بسحب أقطاب التسجيل بعناية ونترك المستحضر جالسا لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للصبغة بالانتشار في العمليات الدقيقة للخلايا العصبية.

بعد ذلك ، انقل الطبق مع التحضير إلى مجهر الفلورسنت. نستخدم عدسة غمر الماء 10 مرات NA 0.3 على مجهر مستقيم ثابت ، والذي يركز عن طريق تحريك العدسة وليس المسرح. هذا يجعل من السهل تركيب المتلاعبين.

بالنسبة لأقطاب التسجيل، حدد كتلة مرشح مناسبة. ستوفر كتلة المرشحات الثلاثة SI مرشحات الإثارة والانبعاث الصحيحة لبرتقالي الكالسيوم ، وضبط معلمات الكاميرا وشدة الإضاءة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة وفتحة المجال. سيؤدي المزيد من الضوء إلى ضوضاء أقل ، ولكن من المحتمل أن يبيض المستحضر.

يمكن لكاميرا CCD المفاجئة الرائعة التقاط مجال 500 × 300 بكسل بمعدل إطارات يبلغ حوالي 30 إطارا في الثانية ، ونسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء. قلل من إضاءة الخلايا العصبية fil عن طريق إبقاء مصراع مصادر الضوء مغلقا كلما أمكن ذلك. في برنامج التصوير، حدد مناطق الاهتمام أو R ois.

تحدد هذه المناطق المكان الذي سيأخذ فيه البرنامج قياسات الشدة. نصور بشكل عام الفروع الأولية والثانوية والثالثية للخلايا العصبية قبل المشبكي. ضع عائد استثمار إضافي بجوار الخلايا العصبية الثنائية للحصول على قيمة خلفية يتم طرحها لاحقا من جميع نقاط البيانات الأخرى.

تستخدم أقطاب التسجيل داخل الخلايا في الخلايا العصبية قبل وبعد التشابك للحث على ومراقبة الإرسال المتشابك. يمكنك ضمان التزامن بين الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية والتصوير إذا كنت تستخدم إشارة تشغيل إطار الكاميرا لبدء تشغيل برنامج الحصول على البيانات. هناك طريقة أخرى لضمان المزامنة وهي تركيب مؤشر LED داخل منفذ الكاميرا.

يتم تشغيل مؤشر LED هذا لفترة وجيزة في بداية جلسة التسجيل ، وبالتالي يوفر علامة التزامن. أثناء تجربة نموذجية ، تقوم بتشغيل إمكانات الفعل في الخلايا العصبية قبل المشبكية عن طريق حقن نبضات تيار قصيرة. في هذا المثال ، نعرض موجة من المسامير والزيادات المقابلة في إشارة الكالسيوم لاختبار فرضيات محددة.

يمكن التلاعب بإشارة الكالسيوم وتحديد التأثيرات على الإرسال المتشابك. على سبيل المثال ، يمكن حقن أدوية مثل مخلب الكالسيوم EGTA قبل المشبكي أو تطبيقها من خلال نظام التروية. يتم تحليل البيانات عن طريق تصديرها من برنامج التصوير إلى ملف نصي ثم إلى البرنامج الذي تم استخدامه للحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية ، والتي في حالتنا هي الارتفاع الثاني بواسطة Cambridge Electronic Design.

نستخدم نصا مكتوبا مخصصا لرسم قيم شدة عائد الاستثمار والتغيرات المقابلة في إمكانات الغشاء لتحديد التغيرات في إشارة الكالسيوم عن طريق طرح إشارة الخلفية التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار في الخلفية وحساب التغيير النسبي مع المعادلة المعروضة. F صفر هو التألق قبل التحفيز مباشرة ، و F هو التألق أثناء التحفيز. نعرض هنا نتائج تجربة قمنا فيها بتصوير التغيرات في مضان الكالسيوم في الخلايا العصبية B 21 المحددة.

يشار إلى المنطقة التي صورناها في A ، في B واحد ، أحدثنا انفجارا من المسامير في B 21 ، مما أدى إلى إمكانات ما بعد المشبكي في B ثمانية وتغيير في إشارة الكالسيوم. يظهر B الثاني تأثير حقن مخلب الكالسيوم. لم تعد طفرات EGTA في B 21 تحفز زيادات واسعة النطاق في مضان الكالسيوم وتقل سعة إمكانات ما بعد التشابك.

في الختام ، أظهرنا تقنيات يمكن استخدامها لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد وتقييم فعالية انتقال الشبكي. تتطلب هذه التقنيات معدات متواضعة فقط مقارنة بمعظم التصوير الوظيفي وهي سهلة وسريعة التعلم.