رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وفعالية متشابك في الرخويات

يُعتقد أن الكالسيوم داخل الخلايا يلعب دوراً هاماً في العديد من آليات اللدونة التشابكية. ويمكن اختبار هذه الأفكار من خلال المراقبة المتزامنة للتغيرات في مستويات الكالسيوم والتغيرات في كفاءة التشابك العصبي. ونوضح هنا كيفية تحقيق ذلك عن طريق الجمع بين تصوير الكالسيوم والتسجيل داخل الخلايا.

تُجرى تجاربنا باستخدام عقدة عصبية من رخويات *Aplysia Cahora*. وتتميز هذه العينة بعدة مزايا، منها وجود عصبونات كبيرة محددة، ودرجات الحرارة المنخفضة الطبيعية لهذه الرخويات، وبطء الإشارات مما يسهل عملية التصوير، إلا أن التقنيات العامة التي نستعرضها يمكن نقلها بسهولة إلى أنظمة أخرى. مرحباً، أنا كولين إيفانز من مختبر إليزابيث كروبير في قسم فيشبورغ لعلوم الأعصاب ومعهد فريدمان للدماغ في كلية الطب بجامعة ماونت سيناي في مدينة نيويورك.

سنقوم اليوم باستعراض التصوير المتزامن للتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وكفاءة التشابك العصبي في العقدة الفموية لحيوان الرخويات Aplysia cahora. ولكشف الكالسيوم داخل الخلايا، سنقوم بحقن عصبون قبل تشابكي بصبغة مؤشر الكالسيوم calcium orange النفاذة عبر غشاء الخلية. ثم يتم نقل التحضير تحت المجهر، ويتم غرز أقطاب حادة في العصبونات قبل التشابكية وبعد التشابكية.

يؤدي التحفيز المتكرر قبل التشابكي إلى استجابة معززة بعد التشابكية تظهر على شكل زيادة في الجهد بعد التشابكي أو سعة PSP. سيتيح لنا قياس الإشارة الفلورية لصبغة مؤشر الكالسيوم اكتشاف التغيرات المتزامنة في الكالسيوم داخل الخلايا قبل التشابكية. للبدء، يتم تخدير حيوان بالغ يزن حوالي 150 جراماً عن طريق حقن 75 mils من محلول كلوريد المغنيسيوم المتساوي التوتر، ثم يتم تثبيت الحيوان المخدر على طبق مغطى بالشمع، وباستخدام ملقط ومقص جراحي، يتم إجراء شق في قدم الحيوان وكشف الكتلة الفموية.

تقع العقدة البقجيّة (buccal ganglion) على الجانب البطني للكتلة البقجيّة وتتكون من نصف عقدتين متصلتين. وتحتوي على عدة مئات من العصبونات التي تساهم، جنباً إلى جنب مع العصبونات في العقد الأخرى، في توليد والتحكم في سلوك التغذية لدى الحيوان. قم بتحرير العقدة بعناية عن طريق قطع جميع الأعصاب البقجيّة باستخدام مقص دقيق، ثم استخرجها من الحيوان.

بعد ذلك، يتم تثبيت العقدة العصبية المحررة في قاعدة طبق مغطى بـ sil guard وملأه بمياه بحر اصطناعية. تكون العقدة العصبية محاطة بغمد من النسيج الضام، والذي يجب إزالته للكشف عن العصبونات الفردية. استخدم ملاقط التحقق، ومقصات القزحية، وتوخَّ الحذر الشديد عند قص هذا الغمد.

ولتجنب إتلاف العصبونات، قم بتثبيت العقدة منزوعة الغمد باستخدام دبابيس لمدة 15 دقيقة تقريبًا، حيث أن أي حركة ستكون إشكالية أثناء التصوير. ولتحضير أقطاب كهربائية حادة للتسجيل داخل الخلوي وحقن الصبغة، قم بسحب أنابيب شعرية باستخدام ساحب أقطاب مجهرية. نحن نستخدم زجاج بوروسيليكات خيطي رقيق الجدران بقطر خارجي يبلغ 1 millimeter.

يجب أن تكون مقاومة أقطاب التسجيل حوالي 10 mega عند ملئها بأسيتات البوتاسيوم بتركيز 3 molar، ولذلك نقوم بضبط جهاز السحب (puller) وفقاً لذلك لملء أقطاب D. اغمس مؤخرة القطب المسحوب في محلول بتركيز 10 millimolar من صبغة الكالسيوم البرتقالية؛ حيث سيعمل الخاصية الشعرية على طول الخيط الزجاجي داخل القطب على سحب الصبغة إلى الطرف، ثم أعد ملء القطب بكلوريد البوتاسيوم بتركيز 200 millimolar لضمان تلامس كهربائي جيد. نحن نستخدم جهاز Bela مصنعاً خصيصاً لتحسين خصائص القطب وخفض مقاومة قطب التسجيل إلى حوالي 5 mega.

يتم تثبيت القطب الكهربائي بزاوية 45 درجة في تيار من معلق أكسيد الألومنيوم. ويسمح خلط كلوريد الصوديوم في المعلق وتوصيله بمقياس أوم بمراقبة مقاومة القطب الكهربائي. وخلال عملية الشطب، نقوم بنقل الطبق الذي يحتوي على عقد العقد العصبية المخدوعة إلى منصة الفيزيولوجيا الكهربائية ونحدد العصبونات المطلوبة عن طريق غرز الأقطاب الكهربائية فيها والتحقق من هويتها.

لتحضير العصبون للتصوير الكالسيومي، نقوم أولاً بإدخال قطب كهربائي مملوء بالصبغة في جسم الخلية ونقوم بتحميل الصبغة كهربائياً باستخدام نبضات تيار بجهد 15 nano amp مفرطة الاستقطاب لمدة 30 دقيقة. ومع دخول صبغة D calcium orange إلى الخلية، سيكتسب جسم الخلية لوناً وردياً باهتاً. بعد ذلك، نسحب أقطاب التسجيل بعناية ونترك التحضير لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للصبغة بالانتشار في الزوائد الدقيقة للعصبون.

بعد ذلك، انقل الطبق الذي يحتوي على التحضير إلى مجهر فلوري. نحن نستخدم عدسة غمر مائية بقوة تكبير 10 مرات وفتحة عددية NA 0.3 على مجهر ذو منصة ثابتة ورأس قائم، حيث يتم التركيز عن طريق تحريك العدسة وليس المنصة. وهذا يسهل عملية تركيب أدوات التحكم الدقيقة.

اختر وحدة ترشيح مناسبة لأقطاب التسجيل. ستوفر وحدة ترشيح SI three مرشحات الإثارة والانبعاث الصحيحة لـ calcium orange، وقم بضبط معلمات الكاميرا وكثافة الإضاءة باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة وفتحة المجال. ستؤدي زيادة الضوء إلى تقليل الضوضاء، ولكنها قد تتسبب في بهتان العينة.

يمكن لكاميرا cool snap CCD التقاط مجال بدقة 500 في 300 بكسل بمعدل إطارات يبلغ حوالي 30 إطاراً في الثانية، وبنسبة إشارة إلى ضجيج جيدة. قلل من إضاءة عصبونات fil عن طريق إبقاء غالق مصادر الضوء مغلقاً كلما أمكن ذلك. في برنامج التصوير، حدد المناطق ذات الأهمية أو R ois.

تحدد هذه المناطق الأماكن التي سيقوم البرنامج فيها بأخذ قياسات الشدة. وبشكل عام، نقوم بتصوير الفروع الأولية والثانوية والثالثية للعصبون قبل المشبكي. ضع منطقة اهتمام (ROI) إضافية بجوار العصبون difi للحصول على قيمة الخلفية التي سيتم طرحها لاحقاً من جميع نقاط البيانات الأخرى.

تُستخدم أقطاب التسجيل داخل الخلوية في العصبونات قبل التشابكية وبعد التشابكية لتحفيز ومراقبة الانتقال التشابكي. يمكنك ضمان التزامن بين الحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربائية وبيانات التصوير إذا استخدمت إشارة تحفيز خروج الإطار (frame out trigger) الخاصة بالكاميرا لبدء برنامج الحصول على البيانات. وهناك طريقة أخرى لضمان التزامن وهي تركيب صمام ثنائي باعث للضوء (LED) داخل منفذ الكاميرا.

يتم تشغيل هذا الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) لفترة وجيزة في بداية جلسة التسجيل، وبذلك يوفر علامة تزامن. خلال التجربة النموذجية، تقوم بتحفيز جهود الفعل في العصبون قبل المشبكي عن طريق حقن نبضات تيار قصيرة. في هذا المثال، نعرض دفقة من الومضات وزيادات مقابلة في إشارة الكالسيوم لاختبار فرضيات محددة.

يمكن التحكم في إشارة الكالسيوم وتحديد تأثيراتها على النقل المشبكي. على سبيل المثال، يمكن حقن عقاقير مثل مادة EGTA المخلبية للكالسيوم في قبل المشبك أو تطبيقها عبر نظام التروية. تُحلل البيانات عن طريق تصديرها من برنامج التصوير إلى ملف نصي، ثم إلى البرنامج المستخدم في الحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربائية، وهو في حالتنا برنامج spike two من إنتاج شركة Cambridge Electronic Design.

نستخدم برنامجاً نصياً مكتوباً خصيصاً لرسم قيم كثافة منطقة الاهتمام (ROI) والتغيرات المقابلة في جهد الغشاء، ولقياس التغيرات في إشارة الكالسيوم عن طريق طرح إشارة الخلفية التي تم الحصول عليها من منطقة اهتمام الخلفية وحساب التغيير النسبي باستخدام المعادلة الموضحة. يمثل F zero الفلورة مباشرة قبل التحفيز، بينما تمثل F الفلورة أثناء التحفيز. نعرض هنا نتائج تجربة قمنا فيها بتصوير التغيرات في فلورة الكالسيوم في العصبون المحدد B 21.

تظهر المنطقة التي تم تصويرها في A، وفي B 1، قمنا بتحفيز دفقة من النبضات في B 21، مما أدى إلى إحداث جهود ما بعد مشبكية في B 8 وتغيير في إشارة الكالسيوم. ويظهر B 2 تأثير حقن مخلب الكالسيوم EGTA؛ حيث لم تعد النبضات في B 21 تحفز زيادات واسعة النطاق في فلورة الكالسيوم، كما انخفضت سعة جهد ما بعد المشبك.

وفي الختام، فقد استعرضنا تقنيات يمكن استخدامها لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتقييم كفاءة النقل التشابكي في آن واحد. ولا تتطلب هذه التقنيات سوى معدات متواضعة مقارنة بمعظم طرق التصوير الوظيفي، كما أنها سهلة وسريعة التعلم.