لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مناطق الحمض النووي المرتبطة بحمض النووي الريبي غير المشفر باستخدام QPCR أو تسلسل عالي الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الربط المتقاطع للخلايا لاحتجاز تفاعلات D-N-A-R-N-A الأصلية في الجسم الحي. كخطوة ثانية ، يتم تحلل الخلايا وإخضاعها للصوتنة لإذابة محللة الخلية والكروماتين المطلق إلى أجزاء صغيرة.

بعد ذلك ، تتم إضافة oligos المضادة للمعنى البيوتينيل إلى محللة الخلية من أجل إثراء مجمعات R-N-A-D-N-A على وجه التحديد ، يتم الحصول على نتائج ذات أهمية توضح هوية المواقع الجينومية المرتبطة بالحمض النووي الريبي غير المشفرة بناء على QPCR أو تسلسل عالي الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل R-N-A-D-N-A FISH ، هي أن الزقزقة تسمح بخرائط واسعة الجينوم لمواقع ربط الحمض النووي الريبي غير المشفرة بدقة زوج القاعدة القريبة. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحمض النووي الريبي غير المشفر ، مثل كيفية تحقيق الصخور والحمض النووي الريبي وذكور الذباب لتعويض الجرعة.

الآثار المترتبة على هذه التقنية ، المدى نحو علاجات الأمراض غير المشفرة المرتبطة ب NA لأنها تسمح بفهم أفضل لكيفية تنظيم الحمض النووي الريبي غير المشفر لحالات الكروماتين والتعبير الجيني. بالنسبة لعزل الكروماتين هذا عن طريق تنقية الحمض النووي الريبي أو تجربة الزقزقة ، سيتم حصاد 40 مليون خلية بعد الطرد المركزي ، وصب PBS وإزالة السائل المتبقي عن طريق الشفط بعناية بزاوية تزيح حبيبات الخلية عن طريق النقر على قاع أنبوب الصقر. أضف 1٪ جلوتارالديهايد المحضر حديثا ، بدءا من حجم صغير وأعد تعليق حبيبات الخلية إلى الحجم الكامل ثم اقلبها لخلط الوصلة المتقاطعة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر أو دوار من طرف إلى طرف ، قم بإخماد تفاعل الربط المتقاطع بحجم 10 من 1.25 مولار جلايسين واتركه على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، سوف تتحول الخلايا إلى اللون البرتقالي الفاتح.

قم بالدوران التالي في 2000 RCF لمدة خمس دقائق ، وقم بصب وشفط المادة الطافية واستنشاقها وغسل الحبيبات ب 20 مل من دوران PBS المبرد مرة أخرى ، وشفط المادة الطافية وأعد تعليق الحنك المغسول المتقاطع باستخدام PBS المبرد. انقل كل مليلتر من الخلايا إلى أنبوب einor وقم بالدوران عند 2000 RCF لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، استخدم طرف الماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بعناية.

فلاش ، قم بتجميد جميع كريات الخلية في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر إلى أجل غير مسمى. لتحضير محللة الخلية للزقزقة ، قم بإذابة كريات الخلايا المتشابكة المجمدة في درجة حرارة الغرفة. اضغط بقوة لإخراج وخلط بيليه الخلية.

قم بتدوير الكريات واستخدم طرف ماصة حاد سعة 10 ميكرولتر لإزالة أي PBS متبقي على ميزان إلكتروني دقيق يصل إلى ملليغرام واحد. تمزيق كتلة أنبوب إينور فارغ. قم بوزن كل حبيبات وسجل وزنها.

أضف 10 × حجم من المخزن المؤقت للتحلل المكمل بمثبط البروتياز الطازج PMSF والآس الفائق في كل أنبوب وأعد تعليق الحبيبات. يجب أن تكون محللة الخلية فور تحضيرها. لا تنقل أكثر من 1.5 مل من المحللة في كل أنبوب صقر سعة 15 ملليلتر وأدخل مجسات الصوتنة التي تثبتها بإحكام.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب في تمزق حيوي ، صوتنة عند أربع درجات مئوية في أعلى إعداد مع 30 ثانية على 45 ثانية من فترات النبض. تحقق من المحللة كل 30 دقيقة. استمر في الصوتنة حتى تختفي محللة الخلية عكرة.

قد يستغرق ذلك من 30 دقيقة إلى أربع ساعات اعتمادا على عدد الأنابيب وحجم العينة ودرجة حرارة الحمام وفترة وقت الصوتنة. عندما يصبح المحلل صافيا ، انقل خمسة ميكرولترات إلى أنبوب أينور جديد. أضف البروتياز الحمض النووي ، المخزن المؤقت K ، ودوامة البروتياز K للخلط والدوران ، واحتضان لفترة وجيزة لمدة 45 دقيقة عند 50 درجة مئوية بعد استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية PCR.

تحقق من حجم الحمض النووي على هلام 1٪ aros. يجب أن يكون الجزء الأكبر من مسحة الحمض النووي من 100 إلى 500 زوج أساسي مما يشير إلى أجهزة الطرد المركزي الصوتنة الكاملة. نقل مليلتر واحد من العينات الصوتية عند 16 ، 100 RCF لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ونقل المادة الطافية إلى أنابيب einor جديدة وتجميد سريع في النيتروجين السائل لبدء إجراء أنابيب ذوبان الجليد من الكروماتين في درجة حرارة الغرفة لعينة زقزقة نموذجية.

باستخدام مليلتر واحد من المحللة ، قم بإزالة 10 ميكرولتر لإدخال الحمض النووي الريبي و 10 ميكرولتر لإدخال الحمض النووي وضعها في أنابيب einor. استمر في وضع الثلج حتى أبعد من ذلك. استخدم نقل مليلتر واحد من كل عينة كروماتين إلى أنبوب صقر سعة 15 ملليلترا.

أضف اثنين من المخزن المؤقت للتهجين إلى كل أنبوب. بعد ذلك ، قم بإذابة المجسات في درجة حرارة الغرفة. يتم تصنيف أوليغوس البلاط الحيوي وفقا لمواقعها على طول الحمض النووي الريبي ويتم فصلها إلى مجموعتين.

يحتوي التجمع المتساوي على جميع المجسات ذات الأرقام الزوجية. ويحتوي التجمع الفردي على مجسات ذات أرقام فردية. يتم إجراء جميع التجارب باستخدام كلا المجمعين اللذين يعملان كعناصر تحكم داخلية لبعضهما البعض.

أحد أكثر الجوانب تحديا في البروتوكول الحقيقي هو أن جميع خطوات التهجين والغسيل يجب أن يتم تنفيذها عند 37 درجة. لضمان درجة حرارة تجريبية ثابتة ، قم بتنفيذ جميع الخطوات في فرن السكن أو بالقرب منه ، أضف الحجم المناسب من المجسات إلى أنابيب معينة. تخلط جيدا وتحتضن عند 37 درجة لمدة أربع ساعات مع رجها قبل 20 دقيقة من اكتمال التهجين.

تحضير الخرز المغناطيسي C واحد. استخدم 100 ميكرولتر لكل 100 مول بيكو من المجسات. اغسل بمخزن مؤقت للتحلل المكملة بملليلتر واحد ثلاث مرات باستخدام مغناطيس Dyna mag ذو الشريطين لفصل الخرز عن المخزن المؤقت.

بعد الغسيل النهائي ، قم بتعليق الخرز في الحجم الأصلي لمخزن التحلل واستكماله مع PMSF الطازج السوبرين ومثبط البروتياز. عند اكتمال تفاعل التهجين لمدة أربع ساعات ، أضف 100 ميكرولتر من الخرز إلى كل مزيج أنبوبي. احتضن جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع حبات الغسيل المهتزة مع ملليلتر واحد من محلول الغسيل المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في الغسيل الأول.

استخدم شريطا مغناطيسيا dyna mag 15 لفصل الخرزات ، وصب وإعادة تعليقها في مخزن غسيل مليلتر واحد ، ونقله إلى أنبوب الاستخلاص المعزز للنفط سعة 1.5 ملليلتر. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة خمس دقائق في الغسيل اللاحق ، وقم بتدوير كل أنبوب في جهاز طرد مركزي صغير ووضع العينة على شريط مغناطيسي dyna mag two لعينة صب دقيقة واحدة. امسح أي قطرات بمنديل كيم وأعد تعليقها في مليلتر واحد.

اغسل المخزن المؤقت ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة خمس دقائق. كرر ما مجموعه خمس غسلات في آخر غسلة Resus. قم بتعليق الخرزات جيدا ، وقم بإزالة 100 ميكرولتر واتركها جانبا لعزل الحمض النووي الريبي ، واحتياطي 900 ميكرولتر لجزء الحمض النووي.

ضع جميع الأنابيب على الشريط المغناطيسي لأنبوب dyna mag وقم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل. بعد دوران قصير ، ضع الأنبوب مرة أخرى على شريط المغناطيس بطرف ماصة حاد سعة 10 ميكرولتر. قم بإزالة مخزن الغسيل المتبقي تماما من كل أنبوب.

يتم عزل كسور الحمض النووي الريبي والحمض النووي لاحقا من عينات الزقزقة للقياس الكمي والتسلسل. يوضح هذا الشكل إثراء التيلوميراز البشري أو الحمض النووي الريبي أو الترك من خلايا HELOC على GA dh. الحمض النووي الريبي الخلوي الوفير الذي يعمل كعنصر تحكم سلبي.

غالبية الحمض النووي الريبي التركي الموجود في الخلية ، حوالي 88٪ تم سحبه عن طريق أداء الزقزقة ، بينما تم استرداد 0.46٪ فقط من الحمض النووي الريبي لسم DH مما يدل على عامل تخصيب يبلغ حوالي 200 ضعف يمكن استخدام المجسات غير المحددة مثل المجسات التي تستهدف LAC ZRNA ، والتي لا يتم التعبير عنها عادة في خلايا الثدييات ، كعناصر تحكم سلبية إضافية. من المتوقع أن تربط مناطق الحمض النووي الهدف. عادة ما يتم إثراء الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر على المناطق السالبة عند قياسه بواسطة QPCR.

يوضح هذا الشكل التحقق من صحة QPCR لأربعة مواقع مرتبطة بالهواء الساخن في الخلايا الليفية الأولية للقلفة البشرية التي يتم تحديدها عن طريق أداء الزقزقة SSE في نفس خط الخلية بينما تعمل مواقع الحمض النووي Turk و GA DH كمناطق تحكم سلبية. أسفرت كل من مجموعات المسبار الزوجية والفردية عن تخصيب مماثل للمواقع المتوقعة المرتبطة بالهواء الساخن على المناطق السلبية. السمة المميزة لمواقع ربط الحمض النووي الريبي الطويلة غير المشفرة الحقيقية.

يمكن الحصول على خريطة عالمية لمواقع ربط الحمض النووي الريبي الطويلة غير المشفرة عن طريق تسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي المخصب بالغرد كما يتضح من هذه البيانات من trla طويل غير مطلي RNA Rocks two ، والذي من المعروف أنه يتفاعل مع كروموسوم X بطريقة مطلوبة لتعويض الجرعة. تم تسلسل كل من العينات الزوجية والفردية بشكل منفصل وإزالة ضوضائها الفريدة لإنتاج مسار من الإشارات المتداخلة حيث تشير كل ذروة إلى مشهد قوي للصخور ملزمة أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم ممارسة تقنية خالية من الحمض النووي الريبي الصحيح باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل نشاف البروتين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل البروتينات التي تتفاعل مع DRNA غير السريري محل الاهتمام بعد تطويره. مهد CHI الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي لرسم خريطة لعمل RN في الخلايا المزروعة والأنسجة الثابتة.