لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مناطق DNA المرتبطة بنوع معين من الحمض النووي الريبي غير المشفر (non-coding RNA) باستخدام تقنية QPCR أو تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق الربط التشابكي للخلايا لاحتجاز تفاعلات DNA-RNA الأصلية داخل الكائن الحي. وكخطوة ثانية، يتم تحلل الخلايا وإخضاعها للموجات فوق الصوتية لإذابة ناتج تحلل الخلايا وتقطيع الكروماتين إلى شظايا صغيرة.

بعد ذلك، تُضاف قليلات النوكليوتيد المضادة للمعنى المبيوتينية إلى مستخلص الخلايا من أجل الإثراء النوعي لمعقدات R-N-A-D-N-A المستهدفة، ويتم الحصول على نتائج توضح هوية المواقع الجينومية المرتبطة بالرنا غير المشفر بناءً على QPCR أو التسلسل عالي الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل R-N-A-D-N-A FISH، هي أن تقنية chirp تسمح برسم خرائط على مستوى الجينوم لمواقع ارتباط الرنا غير المشفر بدقة تقارب دقة الزوج القاعدي. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الرنا غير المشفر، مثل كيفية تحقيق الـ RNAs والصراصير الذكور لتعويض الجرعة.

تتمثل أهمية هذه التقنية في امتداد تطبيقاتها نحو علاجات الأمراض المرتبطة بـ RNA غير المشفر، لأنها تتيح فهماً أفضل لكيفية تنظيم RNA غير المشفر لحالات الكروماتين والتعبير الجيني. وفي تجربة عزل الكروماتين عن طريق تنقية RNA أو تجربة chirp هذه، سيتم حصاد 40 مليون خلية بعد الطرد المركزي، ثم سكب PBS وإزالة السائل المتبقي عن طريق الشفط بعناية وبزاوية مائلة، مع تحريك كتلة الخلايا عن طريق النقر على قاع أنبوب falcon. أضف 1% glutaraldehyde المحضر حديثاً، بدءاً بحجم صغير، وأعد تعليق كتلة الخلايا حتى يكتمل الحجم المطلوب، ثم اقلب الأنبوب للمزج، واتركها للربط التشابكي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على هزاز أو دوّار طرفي. أوقف تفاعل الربط التشابكي بإضافة عُشر الحجم من glycine بتركيز 1.25 molar، واتركها على الهزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، حيث سيتحول لون الخلايا إلى البرتقالي الزاهي.

قم بالتدوير التالي بسرعة 2000 RCF لمدة خمس دقائق، ثم صب وشفط السائل الطافي واغسل الراسب بـ 20 milliliters من PBS المبرد، ثم قم بالتدوير مرة أخرى، وشفط السائل الطافي وإعادة تعليق الراسب المترابط والمغسول باستخدام PBS مبرد. انقل كل milliliter من الخلايا إلى أنبوب einor وقم بالتدوير بسرعة 2000 RCF لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة أربع درجات celsius. بعد عملية الطرد المركزي، استخدم رأس الماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من PBS بعناية.

قم بالتجميد السريع لجميع كتل الخلايا في النيتروجين السائل وخزنها عند درجة حرارة 80- °C لفترة غير محددة. ولتحضير محلل الخلايا لتقنية chirp، قم بإذابة كتل الخلايا المتجمدة والمترابطة تقاطعيًا في درجة حرارة الغرفة. انقر بقوة لفصل وخلط كتلة الخلايا.

قم بطرد الرواسب بالتنظيم المركزي، واستخدم رأس ماصة دقيق سعة 10 µL لإزالة أي كمية متبقية من PBS على ميزان إلكتروني بدقة تصل إلى 1 mg. قم بوزن أنبوب einor فارغ. زن كل راسب وسجل وزنه.

أضف 10 أضعاف حجم محلول التحلل (lysis buffer) المضاف إليه مثبط البروتياز PMSF والـ super ace الطازج إلى كل أنبوب، وأعد تعليق الراسب. يجب تعريض ناتج تحلل الخلايا للتبريد فور تحضيره. انقل ما لا يزيد عن 1.5 ملليمتر من ناتج التحلل إلى كل أنبوب فالكون سعة 15 ملليمتر، ثم أدخل مجسات السونيكة مع ربطها بإحكام.

ضع الأنابيب بعد ذلك في جهاز التقطيع الحيوي (bio rupture)، ثم قم بإجراء الموجات فوق الصوتية عند درجة حرارة 4 °C على أعلى إعداد، مع فترات نبضية تتكون من 30 ثانية من التشغيل و45 ثانية من التوقف. افحص ناتج التحلل كل 30 دقيقة. استمر في استخدام الموجات فوق الصوتية حتى يزول التعكر من ناتج تحلل الخلايا.

قد تستغرق هذه العملية من 30 دقيقة إلى أربع ساعات، اعتماداً على عدد الأنابيب، وحجم العينة، ودرجة حرارة الحمام المائي، وفترة زمن السونكة (المعالجة بالموجات فوق الصوتية). عندما يصبح المستخلص رائقاً، انقل 5 µL إلى أنبوبة anor جديدة. أضف buffer DNA protease K وprotease K ثم استخدم جهاز vortex للمزج وقم بالتدوير السريع (spin down)، ثم حضّن المزيج لمدة 45 دقيقة عند 50 °C، وبعد ذلك استخلص DNA باستخدام طقم تنقية PCR.

تحقق من حجم DNA على هلام agarose بتركيز 1%. يجب أن يتراوح معظم نطاق تلطخ DNA بين 100 إلى 500 زوج قاعدي، مما يشير إلى اكتمال عملية السونيكة. قم بطرد عينات السونيكة في أجزاء حجم كل منها 1 mL بسرعة 16,100 RCF لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، ثم انقل الرائق إلى أنابيب microcentrifuge جديدة وقم بتجميدها سريعاً في النيتروجين السائل لبدء إجراء Chirp. قم بإذابة أنابيب الكروماتين في درجة حرارة الغرفة لعينة Chirp نموذجية.

باستخدام ملليلتر واحد من المستخلص الخلوي (lysate)، اسحب 10 µL كمدخلات لـ RNA و10 µL كمدخلات لـ DNA وضعها في أنابيب einor. تُحفظ على الثلج حتى حين. انقل ملليلتر واحد من كل عينة كروماتين إلى أنبوب فالكون سعة 15 ملليلتر.

أضف 2 mL من محلول التلقيح (hybridization buffer) إلى كل أنبوب. بعد ذلك، قم بإذابة المسابير (probes) في درجة حرارة الغرفة. هذه القليل من النوكليوتيدات المجمعة (tiling oligos) المبيوتنة وموسومة وفقاً لمواقعها على طول الـ RNA ومقسمة إلى مجموعتين.

تحتوي المجموعة الزوجية على جميع المجسات ذات الأرقام الزوجية، بينما تحتوي المجموعة الفردية على المجسات ذات الأرقام الفردية. تُجرى جميع التجارب باستخدام كلتا المجموعتين اللتين تعملان كضوابط داخلية لبعضهما البعض.

أحد أكثر الجوانب تحديًا في البروتوكول الفعلي هو ضرورة إجراء جميع خطوات التهجين والغسيل عند 37 درجة. ولضمان ثبات درجة الحرارة التجريبية، تُنفذ جميع الخطوات داخل أو بالقرب من فرن تحضين. أضف الحجم المناسب من المسابير إلى أنابيب محددة، ثم اخلط جيداً وحضن عند 37 درجة لمدة أربع ساعات مع الرج، وذلك قبل 20 دقيقة من اكتمال عملية التهجين.

قم بتحضير الخرزات المغناطيسية C one. استخدم 100 µL لكل 100 pmol من المجسات. اغسل الخرزات باستخدام 1 mL من منظم التحلل (lysis buffer) غير المدعم ثلاث مرات، مع استخدام المغناطيس Dyna mag two strip لفصل الخرزات عن المنظم.

بعد عملية الغسل النهائية، أعد تعليق الخرزات في الحجم الأصلي من منظم التحلل (lysis buffer) وأضف إليها PMSF طازج ومثبط البروتياز. عند اكتمال تفاعل التهجين الذي استمر لأربع ساعات، أضف 100 µL من الخرزات إلى كل أنبوب مزيج. قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة مع الرج، ثم اغسل الخرزات باستخدام 1 mL من منظم الغسل المسخن مسبقاً إلى 37 °C في الغسلة الأولى.

استخدم شريطاً مغناطيسياً dyna mag 15 لفصل الحبيبات، ثم قم بسكب السائل وإعادة التعليق في 1 mL من محلول الغسيل المنظم، وانقل المزيج إلى أنبوب EOR سعة 1.5 mL. يتم التحضين عند 37 °C مع الرج لمدة خمس دقائق؛ وفي عمليات الغسيل اللاحقة، قم بتدوير كل أنبوب في جهاز طرد مركزي صغير، ثم ضع العينة على شريط مغناطيسي dyna mag 2 لمدة دقيقة واحدة قبل سكب العينة. امسح أي قطرات باستخدام منديل Kim wipe ثم أعد التعليق في 1 mL.

استخدم محلول الغسيل، ثم قم بالتحضين عند 37 °C مع الرج لمدة خمس دقائق. كرر العملية لإجراء خمس غسلات إجمالاً، وفي الغسلة الأخيرة، قم بإعادة تعليق الخرزات جيداً، ثم اسحب 100 µL وضعها جانباً لعزل RNA، مع الاحتفاظ بـ 900 µL لكسر DNA.

ضع جميع الأنابيب على الشريط المغناطيسي dyna mag tube وقم بإزالة محلول الغسيل. وبعد عملية تدوير قصيرة، ضع الأنبوب مرة أخرى على الشريط المغناطيسي باستخدام طرف ماصة 10 microliter مدبب. أزل ما تبقى من محلول الغسيل تمامًا من كل أنبوب.

يتم لاحقاً عزل أجزاء RNA وDNA من عينات chirp لغرض التحديد الكمي والتسلسل. يوضح هذا الشكل إثراء تيلوميراز البشري، أو RNA، أو Turk من خلايا HELOC مقارنة بـ GA dh، وهو RNA خلوي وفير يعمل كعنصر تحكم سلبي.

تم سحب غالبية RNA Turk الموجود في الخلية، بنسبة تقارب 88%، عن طريق إجراء تقنية chirp، بينما تم استعادة 0.46% فقط من RNA GA DH، مما يدل على عامل إثراء يقارب 200 ضعف. يمكن استخدام المجسات غير النوعية، مثل المجسات التي تستهدف RNA LAC Z، والذي لا يتم التعبير عنه عادةً في الخلايا الثديية، كضوابط سلبية إضافية. مناطق DNA المتوقع أن ترتبط بالهدف. وعادةً ما يكون RNA غير المشفر الطويل مُثرياً مقارنة بالمناطق السلبية عند قياسه بواسطة QPCR.

يوضح هذا الشكل التحقق من صحة QPCR لأربعة مواقع مرتبطة بـ hot air في الخلايا الليفية الأولية لالقلفة البشرية، والتي تم تحديدها عن طريق إجراء chirp SSE في خط الخلايا نفسه، بينما تعمل مواقع DNA لـ Turk و GA DH كمنطاق تحكم سلبية. وقد أعطت مجموعات مسابر الزوجية والفردية إثراءً متقارباً لمواقع hot air المرتبطة المتوقعة مقارنة بالمناطق السلبية، وهو ما يعد سمة مميزة لمواقع ارتباط RNA طويلة غير مشفرة حقيقية.

يمكن الحصول على خريطة عالمية لمواقع ارتباط الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل من خلال التسلسل عالي الإنتاجية للحمض النووي المخصب بتقنية chirp، كما هو موضح في هذه البيانات الخاصة بـ long non-coating RNA Rocks two، والمعروف بتفاعله مع الكروموسوم X بطريقة ضرورية لتعويض الجرعة. تم تسلسل العينات الزوجية والفردية بشكل منفصل وتم التخلص من الضوضاء الفريدة لإنتاج مسار من الإشارات المتداخلة حيث تشير كل قمة إلى موقع ارتباط قوي لـ rocks two. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تطبيق تقنية RNAs free بشكل صحيح. بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل لطخة البروتين (protein blot) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد البروتينات التي تتفاعل مع DRNA غير السريري محل الاهتمام بعد تطويره. وقد مهد CHI الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا RNA لرسم خريطة لنشاط RNA في الخلايا المستزرعة والأنسجة المثبتة.