مسعور الملح تعديل Nafion لإنزيم الشلل وتحقيق الاستقرار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تخليق بوليمر لتثبيت الإنزيمات واستقرارها في الخلايا. ولتحقيق ذلك، يتم أولاً دمج معلق nafion مع ملح بروميد الأمونيوم، ثم خلط المزيج باستخدام جهاز vortex لاستبدال صيغة nafion البروتونية بأملاح الأمونيوم. تتمثل الخطوة الثانية في تجفيف البوليمر الناتج عن طريق صب المزيج في قارب وزن وترك المذيبات تتبخر.

بعد ذلك، انقع البوليمر في الماء منزوع الأيونات لمدة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة لإزالة الملح الزائد. وبعد استخلاص الملح، اشطف البوليمر بالماء ثم اتركه ليجف تماماً عن طريق التبخير. وتتمثل الخطوة النهائية في نقل البوليمر إلى قارورة نظيفة وإعادة تعليقه في المذيب لاستخدامه في تثبيت الإنزيمات. وفي النهاية، يُستخدم هذا البوليمر الخاص بتثبيت الإنزيمات لتحسين استقرار الإنزيمات في مقاييس النشاط.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن هذا الإجراء يبدو بسيطًا للغاية، إلا أن عملية التجفيف تعد حاسمة لتصنيع بوليمر فعال. سيقوم أحد طلاب الدراسات العليا في مختبري بتوضيح هذا الإجراء. لبدء عملية تعديل nafion باستخدام أملاح Nerium ammonium، يتم قياس فائض مولاري بمقدار ثلاثة أضعاف بالنسبة لمجموعات sul acid الموجودة في بوليمر nafion من ملح alk ammonium bromide.

انقل ملح بروميد الأمونيوم القلوي إلى قارورة زجاجية بقوة. رج زجاجة من معلق nafion بتركيز 5% وزن/حجم لمدة 30 ثانية تقريباً لضمان تعليق nafion بشكل متجانس في المحلول. اسحب بواسطة الماصة 2 mL من معلق nafion الذي تمت إعادة تعليقه الآن وأضفه إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على ملح بروميد الأمونيوم AGU.

قم برج القارورة باستخدام جهاز الخلط الدوامي (Vortex) بسرعة 900 RPM لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، صب المحلول اللزج في وعاء وزن بلاستيكي واستخدم ماصة لنقل أي محلول متبقٍ من القارورة إلى وعاء الوزن. في هذا المثال، يتم تغطية وعاء الوزن جزئياً ويُترك على طاولة المختبر للسماح للمذيبات بالتبخر تماماً من وعاء الوزن بمعدل تبخر يستغرق أكثر من ست ساعات.

يجب أن يؤدي التبخر الكامل لجميع المذيبات بمعدل التبخر المناسب إلى ترك غشاء شفاف أصفر أو بني في قاع وعاء الوزن كما هو موضح هنا. وإذا تبخر المذيب بسرعة كبيرة، فستتكون مادة قشرية أو بلورية بدلاً من الغشاء الشفاف، مما يشير إلى تدمير البنية المذيلية (micellar structure) للبوليمر. أما إذا كان تبخر المذيب بطيئاً جداً، أو إذا تُرِك ملح الأمونيوم ليتفاعل لفترة طويلة جداً ويمتص الكثير من بخار الماء، فسيؤدي ذلك إما إلى تكون هلام برتقالي لزج أو مادة بلورية بيضاء.

وفي كلتا الحالتين، يجب إعادة بدء الإجراء. بعد تبخر جميع المذيبات بمعدل التبخر المناسب، املأ وعاء الوزن من 10 إلى 20 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات بمقاومة 18 mega ohm centimeter للتغطية، وانقعه لمدة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة لإزالة أملاح بروميد الأمونيوم الزائدة وHBR. بعد 12 إلى 24 ساعة، اسحب الماء باستخدام الماصة وأضف كمية كافية من الماء منزوع الأيونات لملء الوعاء. احرص دائماً على السحب بالماصة بعيداً عن الغشاء البوليمري لتجنب فقدان أي جزء منه.

اشطف المادة ثلاث مرات إجمالاً بعد عمليات الشطف. اترك صينية الوزن مكشوفة حتى يجف البوليمر تماماً. وعندما يجف تماماً، يجب أن يكون البوليمر عبارة عن غشاء بلاستيكي شفاف وهش إلى حد ما.

في المقابل، ستظهر البوليمرات التي لم يتم تجفيفها بشكل صحيح بمظهر مختلف تماماً بعد استخلاص الملح كما هو موضح هنا. باستخدام ملعقة مختبرية، قم بإزالة الغشاء المجفف بعناية من وعاء الوزن وانقله إلى قارورة زجاجية نظيفة. أضف 2 mL من الإيثانول وثلاث خرزات خلط سيراميكية، ثم استخدم جهاز الرج vortex لمدة أربع ساعات أو حتى يتم إعادة تعليق غشاء البوليمر بالكامل.

أصبح محلول الناتيت المعدل بـ alk ammonium الآن جاهزاً للاستخدام في تثبيت الإنزيم. إذا كان الإنزيم المراد تثبيته إنزيماً جافاً، فقم بوزن 1 mg من الإنزيم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، وأضف 1 mL من محلول منظم الفوسفات بتركيز 100 mM وبدرجة pH 7 لتحضير محلول إنزيمي بتركيز 1 mg/mL. انقل 120 µL من محلول الإنزيم بتركيز 1 mg/mL إلى أنبوب جديد.

أضف 60 µL من محلول nafion المعدل بأمونيوم ALK وقم بالرج باستخدام جهاز vortex لمدة 10 ثوانٍ. يجب الحفاظ على نسبة الإنزيم إلى محلول البوليمر بنسبة اثنين إلى واحد في حال الحاجة إلى زيادة حجم هذا المزيج لعدد كبير من المكررات. وأخيرًا، اسحب 60 µL من محلول الإنزيم والبوليمر باستخدام الماصة وضعها في قاع كل من الكيوفيتات الثلاث المنفصلة ذات المساحة 1 cm² واتركها لتجف طوال الليل.

يمكن بعد ذلك تقييم استقرار الإنزيم داخل الغشاء البوليمري عن طريق مقاييس النشاط الإنزيمي كما هو موضح. لبدء هذا المقاييس، أضف الكواشف التالية إلى الوعاء الذي تمت فيه عملية الصب المشترك لبوليمير nafion المعدل وإنزيم dehydrogenase المعتمد على NAD: 1.3 milliliters من sodium pyrophosphate بتركيز 50 millimolar، و1.5 milliliters من nicotinamide adenine dinucleotide (أو NAD) بتركيز 15 millimolar المحضر حديثاً، و0.1 milliliters من الماء.

ضع الأنبوب في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV visible spectrophotometer) مع ضبط الطول الموجي عند 340 نانومتر وتصفير الجهاز. أضف 0.1 ملل من الإيثانول إلى الأنبوب وامزج الكواشف عن طريق سحب المحلول ودفعه برفق باستخدام الماصة خمس مرات. ولتحضير العينة الفارغة (blank)، استخدم 0.1 ملل من الماء الإضافي بدلاً من 0.1 ملل من الإيثانول. وبعد خمس دقائق من إضافة الكواشف إلى الأنبوب، سجل قيمة الامتصاصية عند 340 نانومتر.

سجل الامتصاصية مرة أخرى بعد 20 دقيقة من إضافة الكواشف إلى qve، وسيتم رسم هاتين النقطتين من البيانات للحصول على ميل يمكن استخدامه في حسابات النشاط لقياس النشاط الإنزيمي النوعي لـ pq المثبت. تقوم الـ dehydrogenases المعتمدة على PQQ بنقل هذه الكواشف إلى qve المصبوب مع بوليمر nafion المعدل وPQQ dependent dehydrogenase. 1.5 milliliters من فوسفات الصوديوم و 200 µL من 600 µM pH methyls sulfate أو PMS.

ضع الأنبوب في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV visible spectrophotometer) المضبوط على طول موجي قدره 600 نانومتر وقم بتصفير الجهاز. أضف 100 ميكرولتر من خليط مكون من 700 ميكرولتر من 2,6-dichloroindophenol أو DCIP و 200 ميكرولتر من الركيزة المعنية إلى المقياس الطيفي. اخلط الكاشفات عن طريق سحب المحلول وإطلاقه بلطف باستخدام الماصة خمس مرات لعمل عينة فارغة (blank).

استخدم 200 µL من الماء بدلاً من الركيزة المعنية. بعد خمس دقائق من إضافة الكواشف، سجل الامتصاصية عند 600 nm.

سجل الامتصاصية مرة أخرى بعد 20 دقيقة من إضافة الكواشف لبدء هذا المقايسة. أضف إلى Q VET المصبوب بالبوليمر المطور nafion وجلوكوز أوكسيديز (glucose oxidase) مليليترين من محلول يحتوي على ما يلي: 0.2 molar حمض بارا هيدروكسي بنزويك، و 0.02% Sodium azide، و 128 units من البيروكسيديز، و 0.3 millimolar من 4-aminoantipyrine، و 1 molar فوسفات البوتاسيوم، و 50 millimolars من الجلوكوز.

قم بتحضير المحلول عن طريق سحب السائل وإخراجه بالمصّة خمس مرات. ضع الـ Q vet في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية مع ضبط الطول الموجي عند 510 nanometers. يتم ذلك بعد مرور خمس دقائق من إضافة الكواشف إلى الـ qve.

سجل قيمة الامتصاصية عند 510 نانومتر. ثم سجل قيمة الامتصاصية مرة أخرى بعد مرور 20 دقيقة من إضافة الكواشف. يوضح هذا الجدول نتائج مقايسة نشاط إنزيم جلوكوز ديهيدروجيناز المعتمد على NAD والمثبت على بوليمرات نافيون معدلة ومختارة.

لوحظ أن إنزيم جلوكوز ديهيدروجيناز المعتمد على NAD والمثبت أظهر نشاطاً نوعياً أقل مقارنة بالإنزيم ومحلول المنظم. ويرجع ذلك إلى أن الأغشية البوليمرية تقلل من انتقال الجزيئات الكبيرة، ورغم أن الجلوكوز (وهو المادة الخاضعة للتفاعل في المقايسة) جزيء صغير، إلا أن الإنزيم المساعد NAD يحتاج إلى الانتشار داخل الغشاء وخارجه. وبالنسبة للديهيدروجيناز المعتمد على NAD، فإن قيود الانتقال الناتجة عن التثبيت في البوليمر تؤدي إلى خفض النشاط الإنزيمي الملحوظ.

يوضح الجدول التالي نتائج مقايسة نشاط إنزيم جلوكوز ديهيدروجينيز المعتمد على PQQ والمثبت على بوليمرات نافيون مختارة ومعدلة. ومن المهم ملاحظة النشاط الأعلى للإنزيمات المثبتة على معظم أغشية النافيون مقارنة بالإنزيمات في محلول منظم. وبما أن إنزيم جلوكوز ديهيدروجينيز المعتمد على PQQ هو بروتين مرتبط بالغشاء، فإن النافيون المعدل كاره hydrophobically يوفر بيئة أكثر تشابهاً مع الغشاء مقارنة بالمحلول المنظم لاستقرار إنزيم جلوكوز ديهيدروجينيز المعتمد على PQQ النشط، مما يعزز من نشاط الإنزيم.

وأخيرًا، تظهر في هذا الجدول نتائج المقايسة التمثيلية للنشاط النوعي لإنزيم جلوكوز أوكسيديز (glucose oxidase) للبوليمرات المعدلة من النافيون (nafion) المختارة والمثبتة. وتُظهر المقايسات الإنزيمية لكل من البوليمرات مع كل إنزيم من الإنزيمات الثلاثة أن اتجاهات النشاط النوعي النسبي مقارنة بالإنزيم والمحلول هي دالة في النظام الإنزيمي.

وبناءً على ذلك، يجب تحسين نوع البوليمر الدقيق المطلوب لكل إنزيم. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن خطوة التجفيف تعد حاسمة في هذا الإجراء تحديداً.