الكشف عن MicroRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الجهاز العصبي المركزي للمعلمين وأثناء Neuroinflammation

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل تعبير الـ micro RNA في الخلايا الدبقية الصغيرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ والنخاع الشوكي، ثم تجنيس أنسجة الجهاز العصبي المركزي أو CNS. وفي الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا أحادية النواة من الجهاز العصبي المركزي باستخدام تدرج Percoll، ومن ثم يتم تحديد مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة تقنية FACS.

بعد ذلك، يتم عزل الـ RNA من الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليل جودة العينة. وأخيرًا، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) لجزيء micro RNA محدد محل الاهتمام. وفي النهاية، يمكن استخدام طريقة delta delta CT لإظهار المستوى النسبي للتعبير عن micro RNA معين في الخلايا الدبقية الصغيرة.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبات بسبب فشلهم في عزل عدد كافٍ من الخلايا أحادية النواة من الجهاز العصبي المركزي أو بسبب تلوث العينة بالميلين وحطام الخلايا. وتؤدي كلتا الحالتين إلى تحضير منخفض الجودة، إما بتركيز منخفض من RNA أو بالتلوث بالبروتين على التوالي. سأقوم أنا وvir بتوضيح هذا الإجراء.

بعد إتمام عملية التروية لجميع الفئران، يتم تشريح الأدمغة والحبال الشوكية. ثم يوضع دماغ واحد وحبل شوكي واحد في كل مرة داخل مجانس Dounce سعة 15 milliliter، مع إضافة خمسة milliliters من PBS إلى الأنسجة في كل مرة. وبعد إجراء من 10 إلى 20 ضربة رقيقة، يُمرر الخليج المتجانس عبر مصافي خلايا بقطر 70 micron إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 milliliter، ثم تُطرد الأنابيب مركزياً لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق عند 834 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

بعد التخلص من الطافي، أعد تعليق متجانس الدماغ والنخاع الشوكي المأخوذ من فأرين إلى ثلاثة في 5 إلى 7 ملليلتر من 70% percoll. بعد ذلك، أضف طبقة من 7 ملليلتر من 40% percoll وقم بcentrifugation لمحلول percoll والخلايا لمدة 30 دقيقة عند 850 ×g ودرجة حرارة 20 °C بدون مرحلة تباطؤ (no break). تخلص من الخلايا التالفة والميالين والحطام الموجودة في الجزء العلوي من 70% percoll.

بعد ذلك، قم بجمع الخلايا أحادية النواة عند السطح الفاصل بين محاليل Percoll بتركيز 70% و40%، ثم خفف الخلايا المجمعة في محلول PBS، بنسبة واحد إلى واحد على الأقل. وبعد ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، أعد تعليق الراسب في نصف ملليلتر من محلول PBS وانقلها إلى أنبوب إبندورف سعة 1.7 ملليلتر. ابدأ بنقل 50 ميكرولتر من الخلايا المفروزة بتدرج الكثافة إلى أنبوب إبندورف جديد سعة 1.7 ملليلتر، وأضف 350 ميكرولتر من محلول FACS buffer إلى الأنبوب.

بعد ذلك، قم بإضافة من 5 إلى 10 µL من الأجسام المضادة لـ FCR إلى الأنبوب، ثم حضن الخلايا لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة على الثلج. قسم عينة الخلايا إلى أنبوبين من نوع einor، وأضف إلى أحد الأنابيب 1 µL من الأجسام المضادة لـ CD 11 B و 2 µL من الأجسام المضادة لـ CD 45.

تحضين الخلايا لمدة 10 إلى 15 دقيقة إضافية على الثلج. ضع ملصقاً على الأنبوب الثاني بعنوان "ضابط سلبي" وضعه على الثلج. بعد التحضين مع أجسام مضادة للتلوين، أضف 1 mL من fax buffer إلى كلا الأنبوبين ثم قم بترسيب الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق عند 1200 ×g.

ج. بعد ذلك، يتم تثبيت الكريات في 400 µL من الـ para formaldehyde بنسبة 1% في PBS، مع استخدام جهاز الـ vortex للأنابيب لمنع التكتل. وأخيراً، يتم تحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) باستخدام عينة خلايا التحكم السلبية وBD com beads. ابدأ بتحصين مجموعة مكونة من خمسة إلى 10 من فئران C 57 black six التي يتراوح عمرها بين 8 إلى 12 أسبوعاً عن طريق الحقن تحت الجلد بـ 150 mg من الببتيد MOG 35-55 في 4 mg/mL من complete frons adjuvant لتحفيز EAE. ثم يتم إعطاء سم السعال الديكي (pertussis toxin) عن طريق الحقن داخل الصفاق في اليوم صفر وفي اليوم الثاني بعد التحصين.

بعد عزل الخلايا وصبغها كما هو موضح للتو، قم بتعليق الرواسب في 400 µL من PBS بدلاً من المثبت مباشرة قبل عملية الفرز. ثم املأ أنبوبين من نوع einor سعة 1.7 mL بـ 300 µL من PBS مدعم بـ 10%FBS لجمع العينات. وأخيراً، قم بفرز مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة والبلعمية للحصول على نقاء عالٍ باستخدام استراتيجية تحديد البوابات الموضحة في مخطط الكثافة التمثيلي هذا.

بعد الفرز، أعد تحليل مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم لتحديد مدى نقاء عينات الخلايا المعزولة. وبعد طرد مجموعات الخلايا المفرزة مركزياً عند 1200 ×g لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق، قم بإزالة الراشح بعناية وتجميد كتل الخلايا على الثلج الجاف. بعد ذلك، انقل كتل الخلايا المجمدة إلى الثلج العادي.

لإجراء عملية الإذابة، أضف 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer) من مجموعة أدوات Nirvana، ثم اخلط المحلول الخلوي برفق عن طريق السحب والضخ بالماصة من خمس إلى سبع مرات. بعد ذلك، أضف 30 µL من مادة مضافة للمتجانس (homogenate additive)، وقم برج معلق الخلايا باستخدام جهاز الرج (vortex) لمدة 30 ثانية، ثم ضع الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق. الآن، أضف 300 µL من الفينول الحمضي والكلوروفورم، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز الرج لمدة 30 ثانية أخرى.

بعد ذلك، وبعد طرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 9,500 ×g، انقل بعناية الـ 300 µL العلوية من الطافي الذي يحتوي على الطور المائي إلى أنبوب إيبندورف جديد سعة 1.7 mL. اخلط المحلول مع 375 µL من الإيثانول بتركيز 100%. انقل محتويات الأنبوب بالكامل إلى خرطوشة ترشيح من مجموعة Nirvana، ثم قم بطرد الخرطوشة مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 9,500 ×g. بعد ذلك، تخلص من المحلول المار عبر المرشح.

أضف 700 µL من محلول الغسيل الأول (wash solution one) من مجموعة Nirvana، ثم قم بالتدوير لمدة دقيقة أخرى بسرعة 9,500 ×g بعد غسل الخرطوشة. كرر هذه العملية مرتين إضافيتين باستخدام 500 µL من محلول الغسيل الثاني (wash solution two) من مجموعة Nirvana. استخلص الـ RNA من الخرطوشة باستخدام 60 µL من الماء الخالي من النوكلياز المسخن مسبقاً.

أخيراً، استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لتقييم نقاوة وكمية الـ RNA بعد إجراء تحليل realtime Q-R-T-P-C-R للكشف عن micro RNA في عينات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البلعمية. يمكن إنشاء منحنيات P-R-T-P-C-R لنواتج PCR الموصومة فلورياً لـ mere 1 24 و snow RNA 55 كما هو موضح هنا في الرسم البياني الأول. وتظهر المنحنيات النموذجية لكمية نواتج PCR النوعية الموصومة فلورياً لعينات control snow RNA 55 RNA المعزولة من الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم مقارنة بعدد دورات PCR.

لاحظ كيف يتم تحديد قيم CT لتحليل تعبير snow RNA 55 من المجموعات الخلوية المختلفة عند تقاطع خط الأساس مع الجزء السفلي من النطاق الخطي لمنحنيات Q-R-T-P-C-R، كما هو موضح في الرسم البياني بالخطوط الرأسية الخضراء والزرقاء. وفي هذا الرسم البياني الثاني، يتم عرض كمية منتجات PCR النوعية الموصومة فلورياً لعينات mere 1 24 RNA التجريبية من الخلايا الدبقية الصغيرة أو البلعوميات المشتقة من نخاع العظم مقارنة بعدد دورات PCR. لاحظ كيف يتم تحديد قيم CT لتحليل تعبير mere 1 24 من المجموعات الخلوية المختلفة مرة أخرى عند تقاطع خط الأساس مع الجزء السفلي من النطاق الخطي لمنحنيات Q-R-T-P-C-R، كما هو موضح في الرسم البياني بالخطوط الرأسية الخضراء والزرقاء.

بعد تحديد قيم CT لكل من العينات، كما هو موضح في هذا الجدول للتعبير عن snow RNA 55 وmere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة وBM dms من الفئران السليمة وفئران EAE، اطرح قيمة CT لعينة التحكم snow RNA 55 من قيمة CT لعينة التجربة mere 1 24 لحساب قيم delta CT لكل نسخة مكررة من كل عينة. ثم اطرح delta CT للعينة المرجعية من قيم delta CT للعينات الأخرى لحساب قيم delta delta CT. وأخيراً، يتم حساب المستوى النسبي للتعبير لكل عينة بصيغة 2 مرفوعة لأس ناقص delta delta CT كما هو موضح في مخطط الكثافة هذا.

في حالة العزل الجيد للخلايا الدبقية الصغيرة (microglia) من الجهاز العصبي المركزي الطبيعي، ستمثل 95 إلى 98% من الخلايا خلايا دبقية صغيرة موجبة لـ CD 11 B ومنخفضة لـ CD 45، مع وجود 2 إلى 5% من معلق الخلايا المكون من بلعميات حول وعائية موجبة لـ CD 11 B ومرتفعة لـ CD 45، وأقل من 1% من الخلايا اللمفاوية سالبة CD 11 B ومرتفعة CD 45، أو الخلايا الدبقية النجمية (astroglia) أو الخلايا الدبقية قليلة التغصن (oligodendroglial cells) أو شظايا خلوية سالبة CD 11 B وسالبة CD 45. ومقارنةً بذلك، يظهر في التحضير الرديء تلوث كبير بخلايا سالبة CD 11 B وسالبة CD 45 أو شظايا خلوية مثل الخلايا الدبقية النجمية أو جزيئات الميالين، مما يجعل الخلايا غير مناسبة لعزل RNA والتحليلات اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، قد تتواجد خلايا سالبة CD 11 B ومرتفعة CD 45، مما يشير إلى تلوث بالخلايا اللمفاوية الدموية بسبب عدم كفاية عملية التروية. وفي مخطط الكثافة هذا، تظهر المجموعات الثلاث من الخلايا الموجودة في الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي: الخلايا الدبقية الصغيرة موجبة CD 11 B ومنخفضة CD 45، والبلعميات موجبة CD 11 B ومرتفعة CD 45، والخلايا اللمفاوية سالبة CD 11 B ومرتفعة CD 45.

تظهر جودة الـ RNA كما تم تحديدها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام بعد مقارنة بين عزل جيد وعزل سيئ. عندما يتم عزل الـ RNA بطريقة نظيفة، يظهر سلم الـ RNA والـ RNA الريبوزومي بوضوح، بينما تظهر لطخة ونواتج تحلل ذات وزن جزيئي منخفض عندما تتم عملية العزل بشكل سيئ. وتوضح هذه البيانات النهائية تعبير mere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة الطبيعية لدى البالغين، والخلايا الدبقية الصغيرة لفئران مصابة بـ EAE، والخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الفئران خلال المراحل المبكرة من النمو.

في هذا الرسم البياني الشريطي الأول، يكون التعبير النسبي لـ mere 1 24 أكبر بكثير في الخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي الطبيعي مقارنة بذلك الملحوظ في البلاعم المشتقة من نخاع العظام. وبالمثل، على الرغم من وجود زيادة في RNA الخاص بـ mere 1 24 في البلاعم من الجهاز العصبي المركزي للفئران المصابة بـ EAE، إلا أن الخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال تعبر عن خمسة أضعاف كمية RNA الخاص بـ mere 1 24. ويوضح هذا الرسم البياني الشريطي الأخير كيف يمكن أيضاً تقييم التغيرات في مستوى تعبير mere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الفئران في عمر أسبوع واحد وأسبوعين وأربعة أسابيع مقارنة بالفئران البالغة في عمر ثمانية أسابيع باستخدام هذه الطريقة أثناء محاولة تنفيذ الإجراء.

من المهم تذكر ضرورة توفر كمية كافية وجودة عالية من الخلايا المعزولة، مما سيضمن الحصول على نتائج جيدة للتجربة بأكملها.