الكشف عن MicroRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الجهاز العصبي المركزي للمعلمين وأثناء Neuroinflammation

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل تعبير micro RNA في الخلايا الدبقية الصغيرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ والنخاع الشوكي، ثم تجنيس أنسجة الجهاز العصبي المركزي أو CNS. وفي الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا أحادية النواة من الجهاز العصبي المركزي باستخدام تدرج Percoll، ومن ثم تحديد مجتمع الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق تقنية FACS.

بعد ذلك، يتم عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا الدبقية الصغيرة وتحليل جودة العينة. وأخيرًا، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) لجزيء الـ micro RNA المحدد المستهدف. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام طريقة delta delta CT لإظهار المستوى النسبي للتعبير عن micro RNA معين في الخلايا الدبقية الصغيرة.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبات بسبب فشلهم في عزل عدد كافٍ من الخلايا أحادية النواة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) أو بسبب تلوث العينة بالميالين وبقايا الخلايا. وتؤدي كلتا الحالتين إلى تحضير منخفض الجودة، إما نتيجة لانخفاض تركيز RNA أو التلوث بالبروتين على التوالي. سأقوم أنا وvir بتوضيح الإجراء.

بعد تروية جميع الفئران، يتم تشريح الدماغ والنخاع الشوكي. ثم يوضع دماغ واحد ونخاع شوكي واحد في كل مرة في مجانس "داونز" سعة 15 milliliter مع إضافة خمسة milliliter من PBS إلى الأنسجة في كل مرة. وبعد القيام بـ 10 إلى 20 ضربة خفيفة، يمرر الخليج المتجانس عبر مصفاة خلايا بمسام 70 micron إلى أنابيب مخروطية منفصلة سعة 50 milliliter، ثم تُوضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس إلى سبع دقائق عند 834 ×g ودرجة حرارة أربع درجات Celsius.

بعد التخلص من السائل الطافي، قم بإعادة تعليق متجانس الدماغ والنخاع الشوكي المأخوذ من فأرين إلى ثلاثة فئران في خمسة إلى سبعة ملليلتر من 70% Percoll. بعد ذلك، أضف طبقة مكونة من سبعة ملليلتر من 40% Percoll وقم بطرد محلول Percoll والخلايا مركزياً لمدة 30 دقيقة عند 850 ×g ودرجة حرارة 20 °C دون توقف. تخلص من الخلايا التالفة والميالين والحطام الموجود في أعلى طبقة الـ 70% Percoll.

بعد ذلك، يتم جمع الخلايا وحيدة النواة عند السطح الفاصل بين محلولي Percoll بتركيز 70% و 40%، وتُخفف الخلايا المجمعة في محلول PBS بنسبة لا تقل عن واحد إلى واحد. وبعد عملية الطرد المركزي لترسيب الخلايا، تُعاد تعليق الراسب في نصف ملليلتر من محلول PBS وتُنقل إلى أنبوب إبيدور (eppendorf) سعة 1.7 ملليلتر. ابدأ بنقل 50 ميكرولتر من الخلايا المفروزة بتدرج الكثافة إلى أنبوب إبيدور جديد سعة 1.7 ملليلتر، وأضف 350 ميكرولتر من محلول الفيكس المنظم (fix buffer) إلى الأنبوب.

بعد ذلك، أضف من 5 إلى 10 µL من أجسام مضادة لـ FCR إلى الأنبوب، ثم قم بحضن الخلايا لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة على الثلج. قسّم عينة الخلايا إلى أنبوبين من نوع einor، وفي أحد الأنابيب، أضف 1 µL من أجسام مضادة لـ CD 11 B و 2 µL من أجسام مضادة لـ CD 45.

تحضين الخلايا لمدة 10 إلى 15 دقيقة إضافية على الثلج. قم بتسمية الأنبوب الثاني كعينة ضابطة سلبية وضعه على الثلج. بعد التحضين مع الأجسام المضادة للتلوين، أضف 1 mL من منظم الفاكس (fax buffer) إلى كلا الأنبوبين وقم بطرد الخلايا مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة خمس دقائق عند 1200 ×g.

ج. بعد ذلك، يتم تثبيت الكريات في 400 µL من الـ para formaldehyde بتركيز 1% في محلول PBS، مع رج الأنابيب بجهاز vortex لمنع التكتل. وأخيراً، تُحلل الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry) باستخدام عينة خلايا التحكم السلبية وBD com beads. ابدأ بتحصين مجموعة من 5 إلى 10 فئران من سلالة C 57 black six، تتراوح أعمارها بين 8 إلى 12 أسبوعاً، عن طريق الحقن تحت الجلد بـ 150 mg من ببتيد MOG 35-55 في 4 mg/mL من complete frons adjuvant لتحفيز مرض EAE. ثم يتم إعطاء سم السعال الديكي (pertussis toxin) عن طريق الحقن داخل الصفاق في اليوم صفر وفي اليوم الثاني بعد التحصين.

بعد عزل الخلايا وصبغها كما تم توضيحه للتو، قم بتعليق الرواسب في 400 µL من PBS بدلاً من المثبت مباشرة قبل عملية الفرز. بعد ذلك، املأ أنبوبين من نوع einor سعة 1.7 mL بـ 300 µL من PBS مضاف إليه 10% FBS لجمع العينات. وفي النهاية، قم بفرز مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة والبلعمية لتحقيق نقاء عالٍ باستخدام استراتيجية تحديد البوابات الموضحة في مخطط الكثافة التمثيلي هذا.

بعد الفرز، أعد تحليل مجموعات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البلعمية لتحديد درجة نقاء عينات الخلايا المعزولة. بعد طرد مجموعات الخلايا المفرزة مركزياً عند 1200 times G لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق في جهاز طرد مركزي صغير، قم بإزالة السائل الطافي بعناية وتجميد ركازات الخلايا على الجليد الجاف. بعد ذلك، انقل ركازات الخلايا المجمدة إلى الجليد العادي.

لأغراض الإذابة، أضف 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer) الخاص بطقم Nirvana، ثم اخلط محلول الخلايا بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة من خمس إلى سبع مرات. بعد ذلك، أضف 30 µL من المادة المضافة للمجانس، وقم برج معلق الخلايا باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 30 ثانية، ثم ضع الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق. الآن أضف 300 µL من الفينول الحمضي والكلوروفورم، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 30 ثانية إضافية.

بعد ذلك، وبعد طرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 9,500 ×g، انقل بعناية الـ 300 µL العلوية من السائل الطافي الذي يحتوي على الطور المائي إلى أنبوب إبندورف جديد سعة 1.7 mL. اخلط المحلول مع 375 µL من الإيثانول بتركيز 100%. انقل كامل محتويات الأنبوب إلى خرطوشة ترشيح من مجموعة Nirvana، ثم قم بطرد الخرطوشة مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 9,500 ×g. بعد ذلك، تخلص من المحلول المار عبر المرشح.

أضف 700 µL من محلول الغسيل الأول (wash solution one) من مجموعة Nirvana، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة أخرى بسرعة 9,500 ×g بعد غسل الخرطوشة. كرر العملية مرتين إضافيتين باستخدام 500 µL من محلول الغسيل الثاني (wash solution two) من مجموعة Nirvana. استخلص الـ RNA من الخرطوشة باستخدام 60 µL من الماء الخالي من النوكلياز المسخن مسبقاً.

أخيراً، استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لتقييم نقاء وكمية الـ RNA بعد إجراء تفاعل Q-R-T-P-C-R في الوقت الحقيقي للكشف عن الـ micro RNA في عينات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا البلعمية. يمكن إنشاء منحنيات P-R-T-P-C-R لنواتج PCR لـ mere 1 24 و snow RNA 55 الموصومة فلورياً كما هو موضح هنا في الرسم البياني الأول. وتظهر المنحنيات النموذجية لكمية نواتج PCR النوعية الموصومة فلورياً لعينات snow RNA 55 RNA الضابطة والمعزولة من الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم مقارنة بعدد دورات PCR.

لاحظ كيف يتم تحديد قيم CT لتحليل تعبير snow RNA 55 من المجموعات الخلوية المختلفة عند تقاطع الخط القاعدي مع الجزء السفلي من النطاق الخطي لمنحنيات Q-R-T-P-C-R، كما هو موضح في الرسم البياني بواسطة الخطوط الرأسية الخضراء والزرقاء. في هذا الرسم البياني الثاني، يتم عرض كمية نواتج PCR النوعية المحددة بفلورية لعينات mere 1 24 RNA التجريبية من الخلايا الدبقية الصغيرة أو البالعات المشتقة من نخاع العظم مقارنة بعدد دورات PCR. لاحظ كيف يتم تحديد قيم CT لتحليل تعبير mere 1 24 من المجموعات الخلوية المختلفة مرة أخرى عند تقاطع الخط القاعدي مع الجزء السفلي من النطاق الخطي لمنحنيات Q-R-T-P-C-R، كما هو موضح في الرسم البياني بواسطة الخطوط الرأسية الخضراء والزرقاء.

بعد تحديد قيم CT لكل عينة، كما هو موضح في هذا الجدول للتعبير عن snow RNA 55 و mere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة (microglia) والخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم (BM dms) من الفئران السليمة وفئران EAE، اطرح قيمة CT لعينة التحكم snow RNA 55 من قيمة CT لعينة التجربة mere 1 24 لحساب قيم delta CT لكل مكرر من كل عينة. بعد ذلك، اطرح delta CT للعينة المرجعية من قيم delta CT للعينات الأخرى لحساب قيم delta delta CT. وأخيرًا، يتم حساب المستوى النسبي للتعبير لكل عينة على أنه 2 مرفوعة للقوة ناقص delta delta CT كما هو موضح في مخطط الكثافة هذا.

في حالة العزل الجيد للخلايا الدبقية الصغيرة من الجهاز العصبي المركزي الطبيعي، ستمثل 95 إلى 98% من الخلايا خلايا دبقية صغيرة موجبة لـ CD 11 B ومنخفضة لـ CD 45، بينما تتكون 2 إلى 5% من المعلق الخلوي من البلاعم حول الوعائية الموجبة لـ CD 11 B والمرتفعة لـ CD 45، وسيكون هناك أقل من 1% من الخلايا اللمفاوية السالبة لـ CD 11 B والمرتفعة لـ CD 45 أو الخلايا الدبقية النجمية أو الخلايا الدبقية قليلة التغصن السالبة لـ CD 11 B والسالبة لـ CD 45 أو شظايا خلوية. ومقارنةً بذلك، في التحضير السيئ، يكون هناك تلوث ملحوظ بخلايا أو شظايا خلوية سالبة لـ CD 11 B وسالبة لـ CD 45 مثل الخلايا الدبقية النجمية أو جزيئات الميالين، مما يجعل الخلايا غير مناسبة لعزل RNA والتحليلات اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك، قد تتواجد خلايا سالبة لـ CD 11 B ومرتفعة لـ CD 45، مما يشير إلى تلوث بالخلايا اللمفاوية الدموية بسبب عدم كفاية التروية. وفي مخطط الكثافة هذا، تظهر المجموعات الخلوية الثلاث الموجودة في الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي: الخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ CD 11 B والمنخفضة لـ CD 45، والبلاعم الموجبة لـ CD 11 B والمرتفعة لـ CD 45، والخلايا اللمفاوية السالبة لـ CD 11 B والمرتفعة لـ CD 45.

تظهر جودة الـ RNA المحددة بواسطة الفصل الكهربائي للهلام بعد عملية عزل جيدة مقابل عزل سيئة. عندما يتم عزل الـ RNA بطريقة نظيفة، يكون سلم الـ RNA والـ RNA الريبوزومي واضحين، أما عندما يتم تنفيذ عملية العزل بشكل سيء، فإن التلطخ ومنتجات التحلل ذات الوزن الجزيئي المنخفض تكون واضحة. توضح هذه البيانات النهائية تعبير mere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة الطبيعية لدى البالغين، والخلايا الدبقية الصغيرة للفئران المصابة بـ EAE، والخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الفئران خلال المراحل المبكرة من النمو.

في هذا الرسم البياني الشريطي الأول، يكون التعبير النسبي لـ mere 1 24 أكبر بكثير في الخلايا الدبقية الصغيرة (microglia) من الجهاز العصبي المركزي الطبيعي مقارنة بما لوحظ في البلاعم المشتقة من نخاع العظم. وبالمثل، على الرغم من وجود زيادة في RNA الخاص بـ mere 1 24 في البلاعم من الجهاز العصبي المركزي للفئران المصابة بـ EAE، إلا أن الخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال تعبر عن خمسة أضعاف كمية RNA لـ mere 1 24. ويوضح هذا الرسم البياني الشريطي النهائي كيف يمكن أيضًا تقييم التغيرات في مستوى تعبير mere 1 24 في الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء نمو الفئران في عمر أسبوع واحد وأسبوعين وأربعة أسابيع مقارنة بالفئران البالغة في عمر ثمانية أسابيع باستخدام هذه الطريقة أثناء محاولة تنفيذ الإجراء.

من المهم تذكر ضرورة توفر كمية كافية وجودة عالية من الخلايا المعزولة، وهو ما يضمن الحصول على نتائج جيدة للتجربة بأكملها.