تجهيز الدماغ الأولية للفحوصات الأنسجة السرطانية والخلايا الجذعية تدفق الفرز

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الخلايا التي تبدأ أورام المخ في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق الفصل الميكانيكي والأنزيمي للأورام البشرية الأولية أولا ثم زراعتها في ظروف زراعة خالية من مصل الخلايا الجذعية. تتم مراقبة تكوين الكرة التالية على مدى ثلاثة إلى خمسة أيام.

ثم يتم هضم كرات الورم إنزيميا مرة أخرى ، ويتم تقييم علامات سطحها عن طريق قياس التدفق الخلوي. الخطوة الأخيرة هي فرز الخلايا المطلوبة إلى 96 لوحة بئر أو شرائح شبكة PL لمزيد من التوصيف. في النهاية ، يمكن تقييم القدرة على التجديد الذاتي والتعبير الجيني التفاضلي للمجموعة الفرز عن طريق الحد من تحليل التخفيف والخلية المفرزة R-T-P-C-R.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل تحليل الورم السائب ، هي أنها تعزل مستقبليا ورم المخ الذي يبدأ الخلايا أو مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية. كانت لدينا فكرة عن هذه الطريقة لأول مرة عندما طبقنا ظروف الاستزراع المستخدمة في الأصل للخلايا الجذعية العصبية الطبيعية على مجموعة متنوعة من أورام الدماغ البشرية ، ووجدنا أن طريقة الاستزراع هذه المختارة خصيصا للمجموعات الشبيهة بالخلايا الجذعية التي توضح الإجراء ستكون طلاب الدراسات العليا في أبحاث ما بعد الدكتوراه ، نخالة فان مانين وسارة نولتي ، وفني قياس التدفق الخلوي نيكول ماكفارلاند ، كلهم من مختبرنا ابدأ بإضافة 200 ميكرولتر من ذوبان الجليد إلى 15 ملليلترا من السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي أو السائل النخاعي الدماغي ، ثم وضع الأنبوب في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية. أحضر محلول كلوريد الأمونيوم إلى درجة حرارة الغرفة في هذا الوقت أيضا.

ثم عند خمسة ملليلتر من السائل الدماغي النخاعي إلى حاوية عينة من أنسجة ورم المخ ، قم بتدوير الحاوية لشطفها ثم قم بإخراجها من السائل لإزالة خلايا الدم الحمراء. الآن انقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم 100 ملم واستخدم مقصا وملقطا ناعما لتفكيك الأنسجة إلى تناسق الملاط. ثم اجمع العينة باستخدام ماصة عادية وملقط سعة 10 ملليلتر وانقل شظايا الأنسجة إلى الأنبوب الذي يحتوي على السائل الدماغي النخاعي A الدافئ.

باستخدام liase ، ضع الأنبوب على شاكر الحاضنة عند 30 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. ثم بعد 15 دقيقة ، قم بتصفية تحلل الأنسجة من خلال مصفاة خلية ميكرومتر سبعة D في أنبوب مخروطي 50 ملليلترا. قم بتدوير المرشح لأسفل لمدة خمس دقائق عند 280 GS في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة الحبيبات بعناية وتقييم حجم ولون الحبيبات الناتجة. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS ثم أضف كمية مناسبة من محلول كلوريد الأمونيوم بناء على حجم الحبيبات وتلوث الخلايا الحمراء. ثم بعد حضانة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بتدوير الخلايا بعد غسل ثان في PBS ، وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل للخلايا الجذعية العصبية ، ثم انقل معلق الخلية إلى لوحة زراعة الأنسجة منخفضة للغاية مقاس 60 ملم في الأيام القليلة الأولى.

قم بتعبئة الثقافات بملليلتر إلى ملليلتر من الوسائط حسب الحاجة ، وقم بتغيير الوسائط فقط عندما يصبح اللون أصفر قليلا. ابدأ بنقل ثقافة الورم إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم لشطف اللوحة جيدا ثم أضف الغسيل إلى أنبوب sphe الورم.

بعد تدوير الخلايا ، قم بإزالة الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر إلى ملليلتر من PBS المعقم ثم أضف 10 ميكرولتر من اللياز. يتمثل أحد تحديات هذه التقنية في الحفاظ على صلاحية الخلايا الجذعية السرطانية الصلبة أثناء المعالجة. يتطلب أي تلاعب بالخلايا أثناء الزراعة والارتياح لمسة لطيفة.

بعد ذلك ، احتضن الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة التعليق وتقييمه بصريا. إذا شوهدت كتل متعددة، فاستخدم طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر لتكرار مجموعة الخلايا برفق.

الآن اغسل الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS المعقم ثم بعد إزالة المادة الطافية S ، أعد تعليق الحبيبات في 500 إلى 1000 ميكرولتر من PBS المعقم بالإضافة إلى ملليمولار EDTA. أخيرا ، بعد تقييم عدد الخلية وقابليتها للبقاء باستخدام اللون الأزرق التريان ، اضبط عدد الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر في PBS بالإضافة إلى EDTA. ابدأ بنقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل اختبار إلى أنابيب تدفق فردية مقاس 12 × 75 ملم.

بعد إضافة الأجسام المضادة المناسبة ، احتضن العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسل أي جسم مضاد غير مرتبط في مليلتر من PBS بالإضافة إلى EDTA لكل أنبوب. الآن صب محلول الغسيل ، وصمة عار الأنابيب ثم أعد تعليق كريات الخلية في 300 ميكرولتر إضافي من PBS بالإضافة إلى EDTA. ثم أضف 10 ميكرولتر من صبغة البقاء السبعة A A D إلى كل أنبوب.

بعد احتضان الأنابيب لمدة 15 دقيقة على الأقل على الجليد ، تكون الخلايا جاهزة لتحليل التدفق الخلوي. بعد استخدام عينة التحكم السلبية لضبط معلمات التشتت الأمامي والجانبي ، ارسم منطقة حول الخلايا ذات الأهمية مشابهة لتلك الموضحة في هذا المخطط العلوي التمثيلي. اضبط الجهد على كاشفات التألق المستخدمة لوضع الخلايا السالبة خلال العقدين الأولين حسب الضرورة.

بعد ذلك ، استخدم صبغة الجدوى سبعة أ أ د لإنشاء منطقة ثانية لاستبعاد الخلايا الميتة المشابهة للمنطقة الموضحة في هذه القطعة العلوية التمثيلية. ثم قم بتطبيق كل من بوابات الخلية المبعثرة والخلية الحية على جميع مخططات التألق واستخدم عناصر التحكم الملونة الفردية لطرح أي تداخل طيفي. أخيرا ، قم بتشغيل العينات.

ابدأ مقايسة التخفيف المحدد عن طريق فرز الخلايا المنفصلة عند تخفيف متغير إلى خلية واحدة لكل بئر في آبار فردية للوحة 96 بئرا تحتوي على 200 ميكرولتر من المحيطات العصبية الإعلامية NSC عادة ما تتشكل على مدى سبعة أيام ويمكن حساب معدل تكوين الكرة اللاحق خلال الأيام السبعة الماضية في الثقافة لخلية واحدة R-T-P-C-R. بعد فرز الخلايا المفردة من المجموعات السكانية ذات الأهمية على مواقع التفاعل لشريحة شبكية وافرة ، أضف ميكرولتر واحد من المزيج الرئيسي إلى مركز كل موقع تفاعل ، ثم قم بتغطية كل موقع على الفور بخمسة ميكرولتر من محلول السقف. ثم باستخدام أداة تدوير منزلقة عالية السرعة ، احتضان الشريحة لثلاث دورات درجة حرارة.

بعد النسخ العكسي ، أضف ثلاثة ميكرولتر من الماء الخالي من الدهشة في DN a إلى كل موقع تفاعل. ثم انقل الخليط بالكامل من كل موقع تفاعل إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردية. أخيرا ، لقياس الكمية في الوقت الفعلي ، قم بتشغيل العينات على جهاز تدوير BioRad.

يوضح هذا الشكل الأول فحص التصوير بالرنين المغناطيسي لمريض تمثيلي مصاب بالورم الأرومي الدبقي. يمكن تسمية الخلايا السرطانية المنفصلة بعلامات الخلايا الجذعية السطحية العصبية ، CD 1 33 و CD 15 ، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في مخطط النقطة التمثيلي هذا. هنا ، يتم عرض مخطط التضخيم لتفاعل R-T-P-C-R أحادي الخلية التمثيلي.

يمكن استخدام قيم التصوير المقطعي المحوسب التي تم الحصول عليها من مثل هذه المؤامرة لحساب مستويات التعبير النسبية للجينات ذات الأهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الفصل الأنزيمائي وزراعة أنسجة ورم المخ الأولية لإثراء مجموعات الخلايا الجذعية. ستعرف أيضا كيفية دراسة قدرة التجديد الذاتي والتعبير الجيني التفاضلي لمجموعات الخلايا الجذعية المصنفة عن طريق إجراء تحليل التخفيف المحدود أو الخلية المفرزة R-T-P-C-R.