جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1

الهدف العام من الإجراءات التالية هو توليد قرص منق. واحدة مجاميع قادرة على غزو الخلايا المتلقية. سيتم عرض طريقتين مختلفتين لتحقيق هذا الهدف بالطريقة الأولى.

يتم التعبير عن البروتين الفلوري الذي يشكل قرص البروتين الفلوري في الخلايا المانحة للورم الأرومي العصبي البشري NLF. ثم يتم غسل الخلايا باستخدام PBS التي يتم جمعها وتكذبها دون استخدام المنظفات. يتم هضم الحمض النووي وتنقية المناطق الزراعية باستخدام نظام تدرج السكروز.

تتمتع Agrios المنقاة بهذه الطريقة بكفاءة منخفضة في غزو الخلايا. النهج البديل هو الإفراط في التعبير عن الأحماض الأمينية 5 98 إلى 7 85 من القرص المؤتلف بروتين واحد في الإشريكية القولونية. ثم يتم تمييز جزء البروتين ب DITE 5 94 المحالة بالكلى وتنقيته باستخدام مصفوفة NI NTA التي تزيل أي قرص متعدد الصبغة غير المرتبط المتبقي.

تتمتع إحدى الأجزاء الناتجة عن هذه الطريقة بكفاءة عالية في غزو الخلايا لتقييم غزو الخلية المضيفة. إما قرص البروتين الفلوري المنقى أو القرص المؤتلف أو القرص المؤتلف المسمى. يتم احتضان جزء واحد مع الخلايا المتلقية ذات الأهمية.

ثم يضاف اللون الأزرق Trian لإخماد التألق خارج الخلية ويتم تصور الغزو عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. حتى الآن ، لم يكن تجميع البروتين سمة معترف بها للأمراض العقلية المزمنة مثل الفصام. حيث يكون أحد البروتينات المتعطلة في الفصام هو غزو الخلية المرشحة لمجاميع البروتين هو سمة مميزة لأمراض تأكيد البروتين.

نوضح هنا بطريقتين أن مجاميع البروتين القرصية الغازية للخلايا ، وبالتالي فإن الاضطرابات ذات الصلة بالقرص أو الاعتلال العصبي للقرص الأول هي اضطرابات تأكيدية للبروتين. الطريقتان هما أولا تنقية القرص كامل الطول ، وواحد ASOS من خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي وثانيا ، التعبير عن قرص متعدد الوحدات C. جزء واحد في الإشريكية القولونية بالإضافة إلى التنقية ووضع العلامات بصبغة الفلورسنت.

في حين أن الطريقة الأولى تؤدي فقط إلى غزو خلوي منخفض الكفاءة ل 0.3٪ من الخلايا التي تمتص الميكروسومات المنقاة ، فإن جزء البروتين المؤتلف النقي يصيب ما يصل إلى 20٪ من الخلايا المكشوفة. يجب أن تكون الطرق الموضحة هنا قابلة للنقل إلى بروتينات أخرى حيث تم إثبات تكوين الجسيمات القصوى أو التجميع متعدد الطبقات بشكل مقنع. في كل من الأطباق 10 10 سم.

البذور 1.5 مرة 10 إلى الورم الأرومي العصبي البشري الست وخلايا LF في وسط RPMI 1640 المكمل وتنمو بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الخلايا من 70 إلى 80٪ ملصق ملتقى ، وخمسة أطباق للتعداء باستخدام PC DNA 3.1 MRFP و EGFP الموسومة بالقرص البشري كامل الطول واحد وخمسة للتعداء باستخدام بلازميد EGFP وحده. لكل طبق 10 سم ، اجمع بين 15 ميكروغراما من الحمض النووي البلازميد و 30 ميكرولترا مؤثرا و 750 ميكرولترا.

قم بعمل OPTI MEM في أنبوب طرد مركزي صغير ويقوم بإجراء عمليات السحب لأعلى ولأسفل ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم لنقل الخلايا ، أضف محلول كاشف تعداء الحمض النووي ، بالتنقيط إلى الخلايا تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 بعد 48 ساعة من التعدي مراقبة التعبير عن قرص MRFP كامل الطول واحد وأكد تكوين مناطق زراعية تحت المجهر الفلوري. تحتوي بعض الخلايا على احتوائ بروتين فلوري ضخم كما هو موضح هنا.

يجمع هذا البروتوكول بين طريقة لتنقية أجسام ليوي من أنسجة المخ وبروتوكول عزل الركام الأكبر أو المناطق الزراعية نظرا لأن الطرق الموجودة بالفعل تعتمد على استخدام المنظفات ، فإن عزل البروتين الخالي من المنظفات للتطبيق في فحوصات غزو الخلايا أمر بالغ الأهمية. بعد ذلك ، قم بشفط الغسيل المتوسط باستخدام PBS وأضف 400 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتين. ثم اكشط الخلايا وأضف ملليلترا واحدا من تعليق الخلية و 10 حبات خزفية إلى أنبوب تحلل ملليلتر.

يقوم بعمل ثلاث نبضات 62 على الخالط 24 قبل الخلية. قد تؤدي القوة الميكانيكية للعملية إلى زيادة درجة الحرارة داخل العينة إلى أعلى من 37 درجة مئوية. لذلك يجب توخي الحذر لتبريد العينة على الجليد بعد إجراء التحلل ، بعد تبريد الخلايا على الجليد ، أضف 10 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم 40 وحدة لكل مليلتر من الحمض النووي واحتضانها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الرج.

تحضير 10 مل لكل من وزن 80٪ 50٪ و 20٪ من السكروز لكل حجم في PBS. ثم في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، قم بإعداد تدرج السكروز بدءا من ملليلترين من 80٪ سكروز متبوعا بملليلترين من 50٪ ومليلترين من 20٪ سكروز. صب التدرج ببطء واحرص على عدم إزعاج الطبقات المصبوبة بالفعل.

بعد ذلك ، قم بطبقة المحللة المهضومة فوق التدرج وجهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 1000 مرة جم عند أربع درجات مئوية. عند الانفصال ، اجمع بعناية الواجهة بين طبقة السكروز من 50 إلى 80٪ باستخدام ماصة واخلطها بخمسة أحجام من جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي سعة 15 مليلتر لمدة 15 دقيقة عند 1000 مرة جم عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية واحتفظ بالمنطقة الزراعية التي تحتوي على الحبيبات.

كرر الغسيل مرتين إضافيتين في هذه الواجهة. المناطق الزراعية فلورية ويمكن تصورها في المجهر تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد الغسيل الأخير ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 250 إلى 500 ميكرولتر من PBS. تحتوي هذه الحبيبات على المناطق الزراعية المنقاة.

أضف 10 ميكرولترات من قرص MRFP ، وهو تعليق واحد إلى كل بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SHSY Five Y. يعبر بشكل أساسي عن قرص GFP القابل للذوبان ، طرف C واحد على غطاء زجاجي معقم ينزلق ويحتضن لمدة 48 إلى 72 ساعة بعد الحضانة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بإخماد التألق خارج الخلية بنسبة 0.04٪ أزرق ثلاثي لمدة خمس دقائق.

ثم اغسلها باستخدام PBS لإزالة اللون الأزرق التريان. بعد ذلك ، ضع الطبق على الثلج وأضف 4٪ PFA و PBS لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا. ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المعقم وقم بتركيب زلات الغطاء على شرائح زجاجية بالذهب المطول مع وسيط تركيب DPI.

تأكيد الاستيعاب في غزو خارجي. تم تطبيق مناطق aggro عن طريق التحديد المشترك مع البروتينات المجندة التي تعبر عنها الخلايا المتلقية في صور Zack. يشمل هذا Zack حوالي ستة ميكرومتر في العمق.

24 صورة تم التقاطها بخطوات 200 نانومتر. يضان قرص MRFP منطقة زراعية واحدة موضحة باللون الأحمر يجند القرص الطرفي GFPC العصاري الخلوي. يظهر جزء واحد موضح باللون الأخضر باللون الأصفر ويشير إلى أن المناطق الزراعية قد دخلت العصارة الخلوية المتلقية وجندت بروتين قرص واحد قابل للذوبان سابقا.

في هذا الجزء من البروتوكول ، سيتم تسمية القرص البشري ب DITE 5 94. يسمح هذا D بالمراقبة المباشرة للبروتين المؤتلف دون الحاجة إلى تلطيخ مناعي إضافي. ابدأ بتحرير البروتين المحضر كما هو موضح في المستند المصاحب من شعاع ميركابتو إيثانول عن طريق غسيل الكلى ثلاث مرات في لترين من PBS عند تخفيف من واحد إلى 2000.

بجانب تسمية قرص مليغرام واحد مع DITE 5 94 IDE قم بإذابة مليغرام واحد لكل مليلتر من البروتين في PBS وإضافة خمسة ملليمولار TCEP لاستعادة مجموعات TH الحرة ، أضف 20 ميكرولترا من الصبغة الذائبة DMF إلى التفاعل واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام كاسيت غسيل الكلى SLI مع قطع الوزن الجزيئي 10 ، 000. يقوم دالتون بغسيل البروتين ثلاث مرات في PBS بنسبة واحد إلى 2000 لمدة ساعتين في كل مرة. بعد ذلك لزيادة نقاء البروتين المسمى.

يتم إجراء تنقية تقارب قائمة على علامة الهسهسة على عمود NI NTA. اغسل مليلتر واحد من مصفوفة NI NTA ب 10 ملليلتر. ثم قم بتطبيق بروتين غسيل الكلى المسمى على العمود واتركه يمر فوق العمود.

ببطء ، سيفقد المحلول جزءا من لونه الأزرق بسبب ارتباط البروتين بمصفوفة NTA ، وستبقى الصبغة الحرة غير المسماة في التدفق من خلال. بمجرد إدخال محلول البروتين. العمود ، اغسل العمود ثلاث مرات ب 20 مل PBS لتصفية البروتين ، أضف ملليلترين من PBS يحتوي على 500 ملليمولار أولي إلى العمود.

اضبط الصمام على سرعة بطيئة وإسقاط أثناء مراقبة الشريط الملون على عمود N NI NTA. وللإشارة إلى ذلك ، يحتوي هذا الجزء الملون من الشطف على بروتين مؤتلف مصنف ينقل EIT إلى كاسيت غسيل الكلى SLI وينقل EIT ثلاث مرات إلى 10 ملليمولار NAPI بتخفيف من واحد إلى 2000 لمدة ساعتين لكل منهما لترين بعد غسيل الكلى. ادفع EIT من خلال مرشح حقنة معقم 0.45 ميكرومتر ، ثم قم بتقطيعه خمس مرات 100 ميكرولتر من العينات وقم بالتجميد في النيتروجين السائل.

يجب أن تكون الكمية الإجمالية للبروتين 0.5 إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في كل 100 ميكرولتر من الكمية الصغيرة. لتقييم غزو البروتين ، أضف وسطا يحتوي على خمسة إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر يسمى قرص مؤتلف ، بروتينا واحدا لكل بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على متلقي SH SY خمسة خلايا الورم الأرومي العصبي البشري. تعبر بشكل أساسي عن قرص علامة GFP القابلة للذوبان ، ومحطة C واحدة على زلات غطاء زجاجي معقم تحتضن لمدة 48 إلى 72 ساعة.

إخماد التألق خارج الخلية ، وإصلاح الخلايا وتركيبها كما هو الحال بالنسبة للخلايا المعالجة في المنطقة الزراعية يؤكد غزو البروتين المؤتلف المطبق خارجيا بواسطة Zack Imaging. عندما يتم تناول البروتين المسمى ، يتم اكتشافه داخل محيط الخلايا المتلقية في الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. يشمل Zack ما يقرب من خمسة ميكرومتر من العمق عند 24 خطوة من 220 نانومتر.

هنا يتم تناول القرص المؤتلف ، جزء واحد من 5 98 إلى 7 85 ، الموضح باللون الأحمر ، بواسطة الخلايا المتلقية التي تعبر عن القرص الموسوم ب C الطرفي القابل للذوبان ، وهو القرص الموسوم باللون الأخضر ، لتحديد غزو القرص. تم تنقية إحدى المناطق الزراعية المجمعة للبروتين التي تتكون من قرص بعلامة MRFP بطول كامل ، وواحد من خلايا NLF وتطبيقها على متلقي SH SY خمس خلايا Y كما هو موضح في هذه الصورة كما هو موضح هنا. A-M-R-F-P الموسوم بقرص واحد غزا الجسيم الأكرومي الورم الأرومي العصبي البشري SH SY خمس خلايا Y تعبر عن GFP قابل للذوبان الموسومة على القرص الطرفي C واحد.

علاوة على ذلك ، كان القرص الموسوم ب MRFP قادرا على تجنيد قرص GFP القابل للذوبان في مجاميع غير قابلة للذوبان لتحديد غزو القرص المؤتلف المسمى بضوء DIA ، تم تطبيقه على SH SY خمسة خلايا الورم الأرومي العصبي التي تعبر عن قرص GFP القابل للذوبان كما هو موضح هنا. القرص المؤتلف ، أحد البروتين المبين الموضح باللون الأحمر ، غزا النقاط الصفراء للخلية المتلقية تشير إلى تجنيد GFP القابل للذوبان الموسومة بالقرص الطرفي C واحد في مجاميع تسمى القرص المؤتلف ، أحدهما تم التعبير عنه وتنقيته من الإشريكية القولونية كان أيضا خلية غازية للخلايا العصبية في الجسم الحي عندما تم حقن البروتين متعدد الطبقات بشكل تجسيمي في قشرة الفص الجبهي الإنسي للفئران. يؤكد تصوير زاك وجود قرص مؤتلف بروتين واحد في الخلايا العصبية القشرية للفئران ملطخة بجسم مضاد ضد النوى العصبية.

لقد أظهرنا لك للتو طريقتين لتوليد مجاميع قرص واحد لدراسة غزو الخلايا. باستخدام أي من هاتين الطريقتين ، يمكننا التحقيق في التأثيرات الخلوية لامتصاص القرص الأول دون المتغيرات المربكة المحتملة للتعبير الجيني المؤتلف عن طريق تعدي الحمض النووي الأجنبي. يمكن تطبيق هذه التقنيات للتحقيق في التأثيرات البيولوجية لأمراض البروتين القرص الأول في المختبر في الخلايا ، وفي الجسم الحي عن طريق التلقيح داخل المخ أو أي إدارة أخرى في النماذج الحيوانية.

نحن على ثقة من أن هذه التقنيات قد يتم نقلها أيضا إلى مجاميع البروتين الأخرى في النهاية مع تعديلات طفيفة على البروتوكول المعتمد لكل بروتين معين. عند القيام بهذا الإجراء ، تأكد من تخصيص وقت للتحليل الدؤوب لصور الفحص المجهري متحد البؤر.