الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف مركبات جديدة تعدل نشاط قنوات البوتاسيوم المقوم الداخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الطلاء الأول المحفز للتتراسيكلين ، HK 2 9 3 خلايا ، معبرا عن قناة KIR ذات الأهمية في صفيحة بئر 384. الخطوة الثانية هي تحميل الخلايا بصبغة ثاليوم الفلورية المسماة الأنفلونزا إلى قسمين.

بعد ذلك ، يتم غسل الصبغة غير المدمجة من الخلايا واستبدالها بمخزن مؤقت للفحص يحتوي على تحكم في السيارة أو مركبات اختبار. الخطوة الأخيرة هي إضافة مخزن مؤقت محفز إلى الآبار لبدء تدفق الثاليوم. في النهاية ، يتم استخدام قارئ لوحة التألق لتحديد المركبات التي تغير حركة أيونات الثاليوم عبر قناة KIR. فقير.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على التقنيات الحالية مثل الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح اليدوي هي أنها تمكن المحقق من إجراء مئات التجارب في وقت واحد وآلاف التجارب يوميا. تسمح هذه الطريقة للمحقق بفحص مكتبات الآلاف من الجزيئات الصغيرة لاكتشاف معدلات قنوات البوتاسيوم المصححة الداخلية قبل يوم واحد من تجربة تدفق الثاليوم ، قم بفصل الخلايا وتحديد كثافة تعليق الخلية كما هو موضح في المخطوطة المصاحبة. بعد ذلك ، استخدم وسط BH الذي يحتوي على 10٪ من لوحة FBS المحللة 20 ، 000 خلية وحيدة النسيلة تم نقلها بثبات باستخدام جين قناة KIR ذي الأهمية في كل بئر من صفيحة بئر BD نقية مطلية ب أمين باستخدام مجموعة حرارية متعددة القطرات أو ماصة متعددة القنوات في اليوم التالي ، افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا ملتصقة وموزعة بالتساوي عبر قاع الآبار.

ثم استخدم غسالة ELX 4 0 5 microplate لاستبدال وسط زراعة الخلية بمقايسة HBSS. عازلة عند 20 ميكرولتر لكل بئر. بعد ذلك ، قم بإعداد الأنفلونزا في محلول التحميل 2:00 صباحا D عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة لإذابة 50 ميكروغراما من الإنفلونزا في مسحوقين في 100 ميكرولتر من DMSO اللامائي

أضف الآن 50 ميكرولترا من الوزن 20٪ لكل حجم محلول Onic F1 27 DMSO إلى الصبغة. امزجهم عن طريق سحب العينة برفق. ثم أضف 150 ميكرولتر من الإنفلونزا في 2:00 صباحا onic F1 27 إلى 35 مل من فحص HBSS ، وقم بالتخزين المؤقت واخلطها برفق.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل الصبغة إلى كل بئر يحتوي بالفعل على 20 ميكرولترا من مقايسة HBSS. مخزن مؤقت. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة تقريبا أثناء تحميل الخلايا بالصبغة. قم بإعداد صفيحة تحفيز الثاليوم عن طريق إذابة 0.5 جرام من بيكربونات الصوديوم حديثا في 50 مل من خمسة × محلول تحفيز الثاليوم.

ثم أضف 50 ميكرولترا من المحلول إلى كل بئر من لوح بئر البولي بروبلين 384 بعد تحميل الخلايا بالإنفلونزا في الساعة 2:00 صباحا. اغسل اللوحة بغسالة ELX 4 0 5 microplate. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر أو 40 ميكرولترا من مقايسة HBSS. عد إلى كل بئر وأصبحت اللوحة جاهزة الآن للتجارب.

قم بتحميل ألواح الثاليوم والخلايا في نظام فحص الأدوية الوظيفي Hema Matsu أو قارئ لوحة التصوير الحركي المكافئ مع إمكانات توزيع السوائل المتكاملة واستخدام المرشحات المناسبة للأصباغ القائمة على الفلورسين مثل الأنفلونزا أوه فور. بعد ذلك ، قم بإعداد بروتوكول إضافة واحد لإضافة 10 ميكرولتر من خمس سلاسل X Thallium إلى الآبار المقابلة للوحة الخلية التي تحتوي على 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت لمقايسة HBSS. ثم سجل التألق الأساسي بتردد أخذ عينات واحد هرتز لمدة 10 ثوان على الأقل.

يجب أن يكون التألق من البئر إلى البئر موحدا ومستقرا عبر اللوحة بمجرد إنشاء ظروف طلاء الخلية والغسيل والتحميل المثلى. في غضون ذلك ، استخدم الماصة المدمجة 384 قناة لإضافة المخزن المؤقت لتحفيز الثاليوم إلى كل بئر في وقت واحد ومواصلة التسجيل لمدة دقيقتين على الأقل بحيث يتم التقاط معدل وذروة الزيادة الناجمة عن الثاليوم في التألق للتحليل دون اتصال بالإنترنت. في السلسلة التالية من التجارب ، قم بتقييم توحيد الاختبار وقابليته للتكرار عن طريق طلاء مثبط تحكم في كل بئر آخر من كل عمود وصفا من لوحة بئر 384 وأضف DMSO إلى الآبار الأخرى كتحكم في السيارة.

استخدم ماصة متعددة القنوات. اصنع لوحة DMSO مركبة عن طريق سحب مثبط لقناة KIR المستهدفة بالتركيز المحدد مسبقا عند 80 ميكرولتر لكل بئر و 0.1٪ مركبة DMSO في صفيحة بولي بروبيلين 384 بئر. يتم ذلك عن طريق إضافة مثبط معروف يبدأ في البئر A واحد والتبديل إلى البئر B اثنين وهكذا حتى البئر B 24.

كرر هذا الإجراء مع DMSO بدءا من جيد ، B واحد وهكذا حتى البئر A 24. الآن قم بتحميل الخلية وألواح تحفيز المركب والثاليوم في قارئ اللوحة. ثم قم بإعداد بروتوكول إضافة اثنين لإضافة 20 ميكرولترا من سلسلتي مركب تركيز X إلى الآبار المقابلة للوحة الخلية التي تحتوي على 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفحص HBSS.

أضف المركبات إلى لوحة الخلية واحتضانها لمدة تصل إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سجل الإنفلونزا الأساسية في مضان لمدة 10 ثوان على الأقل. ثم أضف 10 ميكرولتر من خمسة × عازلة الثاليوم إلى كل بئر من صفيحة الخلية.

كرر التجربة في ثلاثة أيام لاحقة لتحديد قابلية تكرار النتائج. استخدم تدفق الثاليوم في DMSO والخلايا المعالجة بالأدوية لحساب قيمة Z prime. مقياس إحصائي للتباين البئر إلى البئر بين مجموعتين من الآبار يحسب Z أولي باستخدام هذه الصيغة بناء على الوسائل والانحرافات المعيارية ل P و N حيث P هي قيمة التدفق غير المقيدة و N هي قيمة التدفق المثبطة بالكامل.

يعتبر الاختبار بقيم ZPrime أكبر من أو تساوي 0.5 في ثلاثة أيام منفصلة مناسبا للفحص عالي الإنتاجية. هذه الأشكال هي بعض الأمثلة على خرائط طلاء الخلايا المستخدمة في أنواع مختلفة من التجارب. يشار إلى مواضع الآبار التي تحتوي على خلايا غير مستحثة أو مستحثة بالتتراسيكلين بألوان مختلفة.

يوضح هذا الشكل خريطة لوحة المصدر المستخدمة لتحديد تركيز الثاليوم الأمثل لتطوير المقايسة والفحص المركب. يمثل التدرج اللوني سلسلة التخفيف الثلاثي الأضعاف التي تتراوح من 100٪ إلى 0.002٪ الثاليوم ، وإليك خريطة شدة مضان تمثيلية بألوان باردة إلى ساخنة ، مما يشير إلى قيم تدفق الثاليوم المنخفضة إلى العالية. يتم استخدام خريطة طلاء الخلية الموضحة هنا مع ملاءمة دالة لوجستية من أربع معلمات إلى الثاليوم CRC لتحديد قيمة EEC 80 البالغة 15٪ الثاليوم.

يوضح هذا الشكل خريطة لوحة المصدر المستخدمة لتحديد تفاوت DMSO للمقايسة. يحتوي العمودان الأول و 24 على مخزن مؤقت للفحص فقط ، بينما يشير تدرج اللون إلى سلسلة التخفيف المزدوجة التي تتراوح من 10٪ إلى 0.01٪ DMSO وهنا خريطة تمثيلية لشدة التألق مع قيم تدفق الثاليوم المنخفضة المشار إليها باللون الأزرق الداكن. يتم هنا تلخيص متوسط قيم تدفق الثاليوم المسجلة من الآبار التي تحتوي على التركيزات المشار إليها من DMSO.

يوضح هذا الشكل الآن خريطة لوحة المصدر المستخدمة لإنشاء منحنيات استجابة التركيز للمثبطات المعروفة لقناة KIR. يشار إلى كل مركب بلون مختلف وعادة ما يتم طلاؤه كسلسلة تخفيف ثلاثية الأضعاف. تظهر هنا خريطة تمثيلية لشدة التألق ، ويوضح هذا الشكل التثبيط المعتمد على الجرعة لمثبط تدفق الثاليوم بعد تطويره وتحسينه.

يمكن أيضا استخدام مقايسة تدفق الثاليوم لإجراء مجموعة متنوعة من فحوصات علم الأدوية الروتينية. تم تكييف مقايسة تدفق الثاليوم سابقا للاستخدام مع قنوات الجهد والبوتاسيوم المربوطة ، والقنوات الكاتيونية غير الانتقائية ، وحتى ناقلات البوتاسيوم. لا تنس أن العمل مع التليوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل استخدام القفازات والتخلص المناسب من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.