الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير طريقة سهلة وبسيطة لإنتاج كرويات (Spheroids) منتظمة وثلاثية الأبعاد من أورام الغدد الصماء العصبية، وطريقة بسيطة لمعالجة التضمين باستخدام HistoGel لدراسة الأنسجة لهذه الكرويات. يتم تحقيق ذلك من خلال طلاء أطباق ذات 24 بئراً بالتساوي باستخدام الرذاذ (aeros)، والتي تُزرع عليها خلايا أورام الغدد الصماء العصبية البشرية في معلق خلوي مفرد. ثم تُحضن الطبقة على هزاز مداري في الحاضنة طوال الليل بسرعة أقل من 40 RPM، وبعد ذلك تُنقل إلى رف ثابت في الحاضنة.

ستتشكل الكرويات بحلول اليوم الثالث أو الرابع، ويتم مراقبة نموها وسلامتها بواسطة مجهر تباين الطور لدراسة أنسجتها. تُغمر الكرويات ثلاثية الأبعاد في مادة HistoGel الدافئة قبل إجراء المعالجة الروتينية بالبارافين، وتُظهر النتائج نمو الكرويات ثلاثية الأبعاد للأورام الغدية العصبية بناءً على الصور التي تم التقاطها أثناء الفحص بمجهر تباين الطور. ويتم تحليل نسيج الكرويات ثلاثية الأبعاد عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوزين (h and e) والتلوين الكيميائي النسيجي المناعي لمقاطع كتل البارافين الخاصة بالكرويات ثلاثية الأبعاد.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطريقة الحالية في كونها بسيطة وسهلة وموثوقة وفعالة من حيث التكلفة. ويمكن لهذه الطريقة أن تسهل الأبحاث في مجال اكتشاف الأدوية من خلال المساعدة في التحديد السريع للأدوية العلاجية لمرضى الأورام العصبية الصماء. وبشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة في البداية على الأقل في تنمية عضوانيات ثلاثية الأبعاد (3D steroids) منتظمة الشكل والحجم.

يكمن المفتاح في ضمان طلاء أطباق الـ 24 بئراً بشكل متساوٍ بـ agros، وكذلك ضمان تشتت معلقات الخلايا المفردة جيداً ودقتها. ولفهم النسيج المرضي للهياكل ثلاثية الأبعاد (3D steroids)، نحتاج إلى إجراء معالجة للأنسجة وصباغة كيميائية نسيجية مناعية. ويعد التضمين النسيجي للهياكل ثلاثية الأبعاد (3D steroids) خطوة أساسية سيتم توضيحها لاحقاً اليوم. ولتحضير محلول 1% augurs لطلاء أطباق الـ 24 بئراً، أضف جراماً واحداً من aeros إلى 100 milliliters من الماء منزوع الأيونات في زجاجة سعة 250 إلى 500 milliliter، ثم قم بالتعقيم باستخدام الأوتوكلاف لتعقيم aeros بعد عملية التعقيم.

انقل الزجاجة إلى حمام مائي درجة حرارته 70 °C لمدة ساعة تقريبًا. لكي تبرد الـ aeros إلى 70 °C، يجب الحفاظ على تعقيم الـ aeros في جميع الأوقات. وباستخدام ماصة تكرارية داخل كابينة السلامة البيولوجية، قم بتوزيع 200 µL من الـ aeros في كل بئر من بئر 2 24.

استخدم أطباقاً ذات قاع مسطح وبها 24 بئراً لهذا البروتوكول. يمكن استخدام أي نوع من الأطباق ذات القاع المسطح التي تحتوي على 24 بئراً، شريطة أن تكون هذه الأطباق قابلة للتصوير باستخدام مجهر تباين الطور. قم بتحريك مادة الـ aeros داخل البئر لضمان تغطيته بشكل متساوٍ. تعتبر كمية 200 µL من الـ aeros مثالية لتكوين سطح مقعر يسمح للكرويات بتشكيل أشكال كروية متناسقة.

بعد حوالي 10 دقائق، تصبح أطباق الـ 24 بئراً المطلية بـ aeros جاهزة للاستخدام. خلايا bon one المستخدمة في هذه التجربة هي خلايا ورم غدي عصبي بنكرياسي بشري أو خلايا NET، يتم الحفاظ عليها في وسط D-M-E-M-F 12 مع 10%FBS في طبق زراعة أنسجة معقم داخل حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة Celsius مع 5%carbon dioxide. عندما تصل خلايا bon one أحادية الطبقة إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80%Co، يتم تحضير معلقات خلوية أحادية في كابينة السلامة البيولوجية.

أزل الوسط واغسل الخلايا بـ PBS مرتين، ثم قم بفصل الخلايا عن الطبق بإضافة 1 mL من trypsin والتحضين عند 37 °C لمدة خمس دقائق. افحص تحت المجهر للتأكد من أن جميع الخلايا قد انفصلت عن الطبق، ثم أضف 9 mL من وسط النمو إلى الـ trypsin.

استخدم الماصة لسحب وخلايا العين ودفعها للأعلى والأسفل بضع مرات لضمان الحصول على معلق خلوي أحادي متجانس. استخدم مصفاة خلايا بقطر مسام 70 micron لترشيح الخلايا. اجمع الخلايا المُرشحة بعد إجراء عد للخلايا، ثم قم بتحضير معلق بتركيز 5,000 خلية لكل milliliter في وسط نمو D-M-E-M-F 12 يحتوي على 10% FBS.

يجب تحديد عدد الخلايا التي سيتم زراعتها تجريبياً بناءً على حجم الكريات في اليوم السادس. ومن الناحية المثالية، يُفضل أن يتراوح حجم الكرية بين 300 إلى 400 ميكرومتر في القطر. ولهذا السبب، نقوم بزراعة ألف خلية لكل 200 µL لكل بئر.

لبدء هذا الإجراء، ضع 200 µL من معلق الخلايا المفردة فوق كل بئر مطلي بـ aeros في أطباق 24 بئر التي تم تحضيرها مسبقًا، ثم أغلق أطباق 24 بئر بشريط إغلاق معقم لمنع التبخر. ضع أطباق 24 بئر المطلية بـ aero والتي تحتوي على خلايا bon one على هزاز مداري مع رج بطيء جدًا في حضانة رطبة عند 37 °C مع 5% carbon dioxide في الهواء، واتركها تحضن طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، انقل الأطباق إلى منصة ثابتة وحافظ على نمو المزارع في الحضانة كل ثلاثة أيام.

أضف 200 µL من وسط النمو إلى كل بئر من آبار الأطباق. ولتجنب إزعاج الـ phe، لامس طرف الماصة بجدار البئر واترك الوسط يتدفق إلى أسفل الجدار داخل البئر؛ ثم راقب تكوّن OID في أطباق الـ 24 بئراً باستخدام المجهر. يبدأ العلاج الدوائي للستيرويدات ثلاثية الأبعاد (3D steroids) في اليوم السادس من الزراعة.

عندما يصل قطر الكريات العضوية (spheroids) إلى حوالي 300 إلى 400 ميكرون، يتم اعتبار هذا اليوم بمثابة اليوم صفر لبدء المعالجة الدوائية في اليوم السادس. يحتوي كل بئر من الأطباق على حوالي 400 µL من الوسط الغذائي لضمان أن تكون تركيزات المعالجات الدوائية بتركيز نهائي 1x في كل بئر؛ ولكل جرعة علاجية، يتم تحضير تركيز يبلغ ثلاثة أضعاف التركيز المطلوب، ثم يُخفف المقدار المناسب من المخزون الدوائي في 5 mL من وسط النمو داخل أنبوب مخروطي سعة 15 mL، وهي كمية كافية لثماني مكررات. تتميز الكريات العضوية في كل صف من أطباق الـ 24 بئرًا بأنها جرعة الناقل (vehicle)، والجرعات 1، و2، و3، و4، و5. وتوجد أربع مكررات لكل جرعة علاجية في كل طبق من أطباق الـ 24 بئرًا.

عادةً ما تُعالج أجهزة PHE ثلاثية الأبعاد في لوحين على الأقل من الأطباق ذات الـ 24 بئراً، مما ينتج عنه ثماني مكررات على الأقل لكل جرعة علاجية. وقبل إضافة العلاج إلى كل بئر، يتم تدوير الأطباق ذات الـ 24 بئراً مركزياً لضمان انتقال جميع التكثفات من الشريط العلوي إلى البئر، وذلك نظراً لخاصية الطفو للمنشط الستيرويدي ثلاثي الأبعاد. ولا يتم إزالة الوسط من كل بئر بعد عملية الطرد المركزي.

لتجنب اضطراب الكرة، أضف بعناية 200 µL من كل جرعة علاجية في الآبار المناسبة على طول جدار كل بئر. أغلق أطباق الـ 24 بئرًا بإحكام باستخدام شريط إغلاق، ثم قم بتحضين المزارع في حضانة رطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون في الهواء. راقب المزارع الستيرويدية ثلاثية الأبعاد عند كل نقطة زمنية مختارة بعد العلاج الدوائي باستخدام مجهر تباين الطور.

تعد العدسة الشيئية بقوة تكبير 5x مثالية لأن الـ PHE تنمو بسرعة لتتجاوز مجال التصوير عند استخدام عدسة شيئية بقوة 10x. يتم التقاط صور للستيرويدات في كل بئر عند كل نقطة زمنية قبل إضافة HistoGel. تُجمع الستيرويدات ثلاثية الأبعاد المضمنة في الشبكة من أطباق الـ 24 بئرًا وتُثبت في 10%Formin.

ضع أنبوباً من HistoGel المبرد في دورق مملوء بالماء. سخّن الدورق في الميكروويف لمدة دقيقة واحدة أو حتى يتحول الجل إلى سائل تماماً. احتفظ بالأنبوب في الدورق المملوء بالماء نفسه طوال فترة الإجراء.

باستخدام ماصة بلاستيكية ذات استخدام واحد، انقل كل الستيرويد إلى قالب خزعة للتجميد (biopsy cryo mold). اترك الستيرويد لمدة دقيقة واحدة حتى يستقر في قاع قالب خزعة التجميد.

حاول التخلص من السائل الموجود في قالب الخزعة المبرد (biopsy cryo mold) باستخدام مناديل Kim wipes. ادفع الستيرويد برفق شديد نحو المركز في قاع قالب الخزعة المبرد باستخدام عود أسنان. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور للحفاظ على الستيرويد برفق شديد في مركز قالب الخزعة المبرد.

أضف طبقة رقيقة من HistoGel الدافئ إلى قالب التجميد الخاص بالخزعة. لا تضف كمية كبيرة من HistoGel، بل ما يكفي فقط لتثبيت الستيرويدات في المركز.

اترك الستيرويد في HistoGel لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة أو حتى يتصلب HistoGel. املأ بقية قالب تجميد الخزعة بـ HistoGel الدافئ واتركه يتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تقريبًا. مباشرة قبل إخراج كتلة HistoGel الخاصة بـ OIDs من قالب تجميد الخزعة.

اترك قالب التجميد على الثلج لمدة دقيقة واحدة، ثم أخرج كتلة HistoGel الستيرويدية السليمة. غلف الكتلة بقطعة من غلاف المواد البيولوجية (bio wrapp) وضعها في كاسيت للأنسجة والخزعات. احفظ كاسيت الأنسجة والخزعات في وعاء يحتوي على 70%ethanol.

لاحقاً، تُجرى إجراءات معالجة الأنسجة الروتينية للتضمين في البارافين عند زراعتها في أطباق ذات 24 بئراً مرمزة بـ aeros. وتظهر خطوط الخلايا العصبية الصماوية المختلفة أشكالاً مجهرية متنوعة كما هو موضح هنا؛ حيث شكل خط الخلايا العصبية الصماوية البنكرياسية البشرية bond one وخط الخلايا العصبية الصماوية الرئوية البشرية H 7 27 أجساماً كروية ثلاثية الأبعاد.

في المقابل، تُظهر خلايا البنكرياس البشرية كتلًا مسامية كبيرة تشبه العنقود، والتي لا تُعتبر عضويات. بعد عملية استزراع الخلايا على طبق مكون من 24 بئرًا مطليًا بـ agros، يحدث عادةً تكوين العضويات متعددة الخلايا بحلول اليوم الثالث أو الرابع، وتصبح هذه العضويات أكثر استدارة بحلول اليوم السادس.

بسبب نقص العناصر الغذائية والأكسجين، تبدأ الخلايا الموجودة في اللب الكثيف للجسم الكروي في الموت في اليوم العاشر تقريباً، وبحلول اليوم السابع عشر، يبدأ الجسم الكروي في التحلل. ونظراً للحجم الكبير أو في بعض الحالات طرد الحبل التنخري، يمكن أن يصل قطر الجسم الكروي عادةً إلى 1000 microns.

في هذه التجربة، تم اختيار الأشباه العضوية ثلاثية الأبعاد في اليوم السادس كنقطة بداية للمعالجة بمثبط إنزيم نزع أسيتيل الهيستون trikes statin A أو TSA. وقد تم الإبلاغ سابقاً عن أن مثبطات إنزيم نزع أسيتيل الهيستون تظهر تأثيرات مضادة للتكاثر وتأثيرات بروتونية على خلايا NET. تتتبع هذه الصور شكل الأشباه العضوية ثلاثية الأبعاد في بداية المعالجة وبعد مرور 24 و48 و72 و96 ساعة.

يشير الحرف V إلى المعالجة بالمادة الناقلة (Vehicle)، وهي DMSO في هذه الحالة. وتمثل الرموز من D1 إلى D5 المعالجة بجرعات متزايدة من TSA. كما تم تقدير حجم الـ OID لكل فرد تلقائياً بواسطة برنامج حاسوبي تم تطويره خصيصاً باستخدام MATLAB.

تم قياس ثماني كرات (sphs) على الأقل لكل جرعة من علاج TSA عند كل نقطة زمنية، وتم تمثيل النتائج في هذا الرسم البياني بالنسبة للمادة الحاملة (vehicle). أظهرت جميع جرعات TSA درجة معينة من تثبيط النمو في عضويات OIDs ثلاثية الأبعاد. وعند تركيزات TSA البالغة 125 nano molar و 250 nano molar، تم تثبيط نمو الستيرويدات ثلاثية الأبعاد بقوة لفهم النسيج المرضي للستيرويد ثلاثي الأبعاد الصافي.

أُجري صبغ الـ H and e والصبغ الكيميائي النسيجي المناعي على العضواني ثلاثي الأبعاد الذي تم استزراعه لمدة 17 يومًا. يُعد KI 67 علامة للخلايا المتكاثرة، بينما يُعد cleaved caspase three علامة للخلايا المبرمجة. وتشير النتائج إلى أن خلايا الطبقة الخارجية للعضواني ثلاثي الأبعاد تتكاثر بنشاط، بينما تكون الخلايا الموجودة في اللب نخرية أو مبرمجة في الغالب.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء فحوصات إضافية مثل مقايسة توهج عيار الخلايا (cell titer glow assay) من أجل تحديد حيوية هذه الخلايا في هذه الكتل العضوية ثلاثية الأبعاد. وبعد تطوير هذه التقنية، يمكن تعميمها على أطباق ذات 96 بئراً لإجراء عمليات مسح عالية الإنتاجية، مما سيسهل اكتشاف الأدوية العلاجية في أبحاث السرطان.