الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

الهدف العام من التجارب التالية هو إنتاج ركائز RNA لدراسة إنزيم Cas Endonuclease، والذي يلعب أدواراً حاسمة في أنظمة المناعة crispr Cass الموجودة في البكتيريا وArcHa للحصول على ركائز RNA لإنزيم Cas Endonuclease. ويمكن استخدام تضخيم PCR لمنطقة CRISPR محددة للحصول على قالب DNA طويل لإنتاج RNA في المختبر، إذا كان ذلك مفضلاً.

يمكن تلدين أوليغونوكليوتيدين لإنتاج قوالب أقصر لإنتاج الـ RNA الركيزة. وبدلاً من ذلك، يمكن بعد ذلك اختبار تتابعات متكررة قصيرة ومصنعة حسب الطلب في مقايسات إنزيم CAS Endonuclease. وفي النهاية، يمكن تصور إنتاج نسخ الـ RNA والقطع اللاحق بواسطة إنزيم CAS six endonuclease عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي.

الهدف الرئيسي من التقنيات المعروضة هو تمكين الباحثين من دراسة معالجة CRISPR RNA باستخدام ركائز RNA ذات أطوال متفاوتة. ولذلك، يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد جزيئات RNA صغيرة، مثل عناصر التكرار المفردة، أو جزيئات RNA أكبر مثل نسخ crispr RNA التي تمتد عبر عدة فواصل. ورغم أن هذه الطرق توفر رؤى محددة حول نضوج CRISPR RNA، إلا أنه يمكن اعتماد استراتيجيات مشابهة لتحضير القوالب لأنظمة معالجة RNA الأخرى. سيقوم بشرح الإجراء طالب دراسات عليا وباحث ما بعد الدكتوراه، وكلاهما من مختبر متخصص في أنظمة CRISPR المناعية في البكتيريا والأثريات.

يمكن إدراج تسلسل DNA فيروسي يسمى البروتوسبيسر (proto spacer) بين عنصرين متكررين في عنقود CRISPR نامٍ خلال عملية تسمى التكيف. بعد ذلك، يتم نسخ عنقود CRISPR بأكمله ثم معالجته إلى جزيئات RNA صغيرة خاصة بـ CRISPR بواسطة إنزيم كاس إندونيوكليز (Cas Endonuclease)، مثل CAS six. ثم تدمج جزيئات CRISPR RNA الصغيرة هذه في معقد البروتين CAS cascade وتتوسط دفاع المضيف ضد الهجوم الفيروسي المتكرر، وذلك باستخدام التكامل القاعدي بين CRISPR RNA والبروتوسبيسر كإشارة لتحلل DNA الفيروسي لتوليد ركائز CRISPR RNA أولية طويلة.

ابدأ بتصميم بادئات PCR، مستهدفاً مناطق الفاصل (spacer regions) في عنقود CRISPR عن طريق إضافة تسلسل محفز بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 إلى البادئة الأمامية. ثم أضف مواقع إنزيمات القطع إلى كلتا البادئتين لاستنساخ ناتج PCR في ناقل. لاحظ أن بوليميراز الحمض النووي الريبوزي T7 يتطلب بقايا G لضمان البدء الصحيح لعملية النسخ بعد تضخيم تسلسل pre-CRISPR RNA المطلوب من الحمض النووي الجينومي بواسطة PCR.

قم بفصل نواتج تفاعل PCR باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام (gel electrophoresis)، ثم استخلص النطاق المطلوب من الهلام، وبعد ذلك قم بهضم ناتج PCR باستخدام إنزيمات القطع لإنشاء نهايات لزجة. بعد ذلك، وبعد تنقية ناتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR للتخلص من أي نواتج ثانوية لعملية القطع، أضف T4 DNA Ligase، ومحلول T4 DNA Ligase buffer، وبنسبة مولارية تبلغ 3:1 من ناتج PCR المقطوع إلى ناقل pUC19 ذي النهايات اللزجة المقابلة. الآن، قم بتحضين تفاعل الربط عند درجة حرارة 16 °C طوال الليل، ثم قم بتحويل الخليط إلى خلايا e coli DH5α المختصة باتباع البروتوكولات القياسية، مع استخدام فحص اللون الأزرق والأبيض (blue white screening) لتحديد عمليات الربط الناجحة.

أخيرًا، اعزل البلازميدات من المستعمرات البيضاء باستخدام طقم تحضير البلازميدات، وحدد النسائل الموجبة عن طريق تسلسل البلازميد لإنتاج ركائز pre CRISPR RNA ذات حجم متوسط. ابدأ بتصميم قليلات النيوكليوتيد الأمامية والعكسية بتسلسل مسافات تكرار CRISPR المطلوبة بشكل مشابه للتسلسلات الموضحة هنا. لاحظ أن قليلات النيوكليوتيد تحتوي على تسلسل محفز T7 RNA polymerase بالإضافة إلى مواقع تقييد طرفية بعد إنهاء قليلات النيوكليوتيد لضمان تكوين نهايات لاصقة.

بعد ذلك، يتم تحضين العينات مع T4 polynucleotide kinase ومحلول T4 polynucleotide kinase buffer لمدة ساعة واحدة عند 37 °C لإضافة مجموعة فوسفات إلى الطرف '5 لـ 1 nmol من كل من الأوليغونوكليوتيدات. ثم يتم تحضين الأوليغونوكليوتيدات الأمامية والعكسية المفسفرة مع T4 DNA ligase buffer لمدة خمس دقائق عند 95 °C على وحدة تسخين (heating block). وبعد تهجين العينات، يتم إيقاف مصدر الحرارة وترك الخليط ليبرد لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريباً حتى تصل العينات إلى درجة حرارة الغرفة.

الآن، قم بربط قليل النيوكليوتيدات (oligonucleotides) المُجهزة مع مزيج التهجين المكون من ناقل P المهضوم ومنزوع الفوسفات، ومخفف DNA Ligase، وإنزيم T4 DNA Ligase عند درجة حرارة 16 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، قم بتحويل البلازميدات المربوطة إلى خلايا e coli من سلالة DH5α المختصة باتباع البروتوكولات القياسية، مع استخدام فحص اللون الأزرق والأبيض لتحديد عمليات الربط الناجحة. وأخيرًا، قم بعزل البلازميدات وتحديد المستنسخات الإيجابية عن طريق الهضم ثم تسلسل البلازميد.

يمكن تصميم تسلسلات قصيرة من ركائز الـ RNA الخاصة بـ cas ذات التكرار المنفرد بشكل مشابه لتلك الموضحة هنا. تأكد من تضمين ديوكسي ريبونوكليوتيد. وفي حال الرغبة في تحديد موقع قطع الـ RNA، يمكن حينئذٍ الاستعانة بمرفق تخليق مخصص لتنفيذ إنتاج أوليغونوكليوتيد الـ RNA.

بعد عزل البلازميدات التي تحمل الركيزة المخصصة المختارة، استخدم مجموعة تنقية البلازميدات (maxi prep) لإجراء عملية خطية (linearize) للبلازميدات باستخدام إنزيم التقييد الذي يقطع في اتجاه المصب (downstream) من القطع المستنسخة. ثم بعد التأكد من الهضم الكامل، قم بتنقية البلازميد الخطي عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. استرجع الأحماض النووية عن طريق إعادة تعليق الراسب في ماء معقم معالج بـ DEPC.

قم الآن بحضن البلازميدات الهضمية في مزيج نسخ نسخ T7 RNA polymerase المختبري المحضر حديثاً والذي يحتوي على ATP و CTP و GTP و UTP لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. أخيراً، قم بتحليل نسخ RNA التي تم الحصول عليها باستخدام هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12% يحتوي على يوريا بتركيز 8 molar منزوعة الطبيعة. ومن الممكن أيضاً تنقية النسخ عبر كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني Mono Q، ثم استعادة النسخ عن طريق ترسيب الإيثانول لكسور RNA وإعادة تعليق الرواسب في ماء معقم معالج بـ DEPC لتحليل الركائز المصممة بواسطة مقايسات الإنزيم القطاعي؛ ابدأ بتصوير حزم الركيزة عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي وتنقية نواتج التفاعل عن طريق الاستخلاص من هلام يوريا بتركيز 8 molar منزوع الطبيعة.

هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12%، ثم يتم إنتاج وتنقية بروتينات cas المؤتلفة المطلوبة عبر الترسيب الحراري، وكروماتوغرافيا النيكل NTA، كما هو موضح لبروتين CAS six من بكتيريا Clostridium thermo cell. بعد ذلك، يتم دمج بروتين CAS مع خليط تفاعل إندونوكلياز مُحضّر حديثاً لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح بحدوث تفاعل مقايسة الإندونوكلياز. وأخيراً، يتم تحميل 5 من خليط التفاعل على يوريا بتركيز 8 مولار.

هلام بولي أكريلاميد بنسبة 12% وتصور نواتج الانقسام بعد الرحلان الكهربائي بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. يظهر هنا هلام بولي أكريلاميد مصبوغ بـ hine blue لأوليغونوكليوتيد RNA مصمم خصيصاً ونسختين من RNA تم إنتاجهما في المختبر. يلاحظ أن كفاءة إنتاج RNA تختلف بين البنى ذات الأطوال القصيرة والطويلة والمتوسطة.

يتطلب استقصاء نشاط إنزيم القطع الداخلي لـ RNA وجود ضوابط إيجابية وسلبية، بالإضافة إلى بروتينات cas مأشوبة عالية النقاء. في هذا الشكل، يظهر جل SDS-PAGE لتحضير عينة من CAS six من بكتيريا Clostridium thermo cell.

يظهر هنا تشغيل كروماتوغرافيا النيكل NTA إلى جانب علامة بروتينية قياسية بعد الترسيب الحراري. يجب أن تحتوي عينة ضابطة سلبية مناسبة على محلل خلوي بدون تعبير عن CAS six، ولكن باتباع إجراء تنقية CAS six المتطابق، تبيّن أن تحضير CAS six يمتلك المستوى العالي المطلوب من النقاء. هنا، يمكن تصور قطع ركيزة تسلسل متكرر مُعلم في الطرف خمسة برسوم ذاتية الإشعاع بواسطة بروتين CAS six من Clostridium thermo cell.

تحتوي كل حارة على ركيزة مُوسومة إشعاعياً، أو RNA بعد الحضن مع بروتين ca six كما تشير علامات الزائد، أو مع محلول منظم كضابط سلبي كما تشير علامات الناقص، وركائز طويلة أو ركائز قصيرة مع أو بدون إضافة deoxy ribonucleotide عند الموضع ناقص تسعة، والتي استُخدمت لتسهيل تفاعل الإنزيم القاطع داخلياً. لاحظ غياب انشطار الركائز القصيرة عند إدراج deoxy ribonucleotide في جزيء RNA بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن أيضاً استخدام نوكليازات CAS six كأداة لتوليد جزيئات RNA ناضجة ودقيقة. ويمكن دمج جزيئات RNA هذه في معقدات cascade للحصول على رؤى حول دورها في التداخل مع الهجمات الفيروسية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وإنتاج ركائز CRISPR es لنوكليازات Cas.

تُعد هذه الركائز المختلفة مفيدة لمعالجة الأسئلة المتعلقة بنضج واستخدام crispr Es.