الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

الهدف العام من التجارب التالية هو إنتاج ركائز RNA لدراسة إنزيم Cas Endonuclease، والذي يلعب أدواراً حاسمة في أنظمة CRISPR-Cas المناعية الموجودة في البكتيريا والعتائق (Archaea) للحصول على ركائز RNA لإنزيم Cas Endonuclease. ويمكن استخدام تضخيم PCR لمنطقة CRISPR محددة للحصول على قالب DNA طويل لإنتاج RNA في المختبر، إذا كان ذلك مفضلاً.

يمكن ربط أوليغونوكليوتيدين لتوليد قوالب أقصر لإنتاج RNA الركيزة. بدلاً من ذلك، يمكن بعد ذلك اختبار تسلسلات تكرارية قصيرة ومصنعة حسب الطلب في فحوصات إنزيم القصر CAS Endonuclease. وفي النهاية، يمكن تصور إنتاج نسخ RNA والقطع اللاحق بواسطة إنزيم القصر CAS six من خلال التصوير الشعاعي الذاتي.

يتمثل الهدف الرئيسي من التقنيات المقدمة في تمكين الباحثين من دراسة معالجة CRISPR RNA باستخدام ركائز RNA ذات أطوال متفاوتة. ولذلك، يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد جزيئات RNA صغيرة، على سبيل المثال، عناصر تكرار فردية، أو جزيئات RNA أكبر مثل نصوص CRISPR RNA التي تمتد عبر عدة فواصل. ومع أن هذه الطرق توفر رؤية محددة حول نضج CRISPR RNA، إلا أنه يمكن اعتماد استراتيجيات تحضير قوالب مماثلة لأنظمة معالجة RNA الأخرى. سيقوم بتقديم الإجراء طالب دراسات عليا وباحث ما بعد الدكتوراه، كلاهما من مختبر متخصص في أنظمة CRISPR المناعية في البكتيريا والأثريات.

يمكن إدخال تسلسل من الحمض النووي الفيروسي يسمى proto spacer بين عنصرين متكررين في عنقود CRISPR نامٍ من خلال عملية تسمى التكيف. بعد ذلك، يتم نسخ عنقود CRISPR بأكمله ثم معالجته إلى جزيئات CRISPR RNA صغيرة بواسطة إنزيم Cas Endonuclease، على سبيل المثال، CAS six. ثم يتم دمج جزيئات CRISPR RNA الصغيرة هذه في معقد بروتين CAS cascade، والتي تتوسط دفاع المضيف ضد الهجوم الفيروسي المتكرر، وذلك باستخدام التكامل القاعدي بين CRISPR RNA و proto spacer كإشارة لتحلل الحمض النووي الفيروسي لإنتاج ركائز pre CRISPR RNA طويلة.

ابدأ بتصميم بادئات PCR، مستهدفاً مناطق الفاصل (spacer regions) في عنقود CRISPR عن طريق إضافة تسلسل محفز T7 RNA polymerase إلى البادئة الأمامية. بعد ذلك، أضف مواقع قطع لإنزيمات التقييد إلى كلتا البادئتين لاستنساخ ناتج PCR في ناقل (vector). لاحظ أن T7 RNA polymerase يتطلب وجود بقايا guanine لبدء عملية النسخ بشكل صحيح بعد تضخيم تسلسل pre CRISPR RNA المطلوب من الحمض النووي الجينومي بواسطة PCR.

افصل نواتج الـ PCR باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام (gel electrophoresis) واستخلص الحزمة المطلوبة من الهلام، ثم قم بهضم ناتج الـ PCR باستخدام إنزيمات القطع لإنشاء نهايات لاصقة. بعد ذلك، وبعد تنقية ناتج الـ PCR باستخدام طقم تنقية الـ PCR للتخلص من أي نواتج ثانوية لعملية القطع، أضف T4 DNA Ligase ومحلول T4 DNA Ligase buffer، وبنسبة مولارية تبلغ 3:1 من ناتج الـ PCR المقطوع إلى ناقل pUC vector ذو النهايات اللاصقة المقابلة. الآن، قم بحضن تفاعل الربط عند درجة حرارة 16 °C طوال الليل، ثم قم بتحويل الخليط إلى خلايا e coli DH5α المختصة باتباع البروتوكولات القياسية باستخدام فحص اللون الأزرق والأبيض (blue white screening) لتحديد عمليات الربط الناجحة.

أخيرًا، قم بعزل البلازميدات من المستعمرات البيضاء باستخدام مجموعة تحضير البلازميدات، وحدد المستنسخات الإيجابية عن طريق تسلسل البلازميد لتوليد ركائز pre CRISPR RNA ذات حجم متوسط. ابدأ بتصميم قليل نيوكليوتيد (oligonucleotides) أمامي وعكسي يتضمن تسلسلات مسافات تكرار CRISPR المطلوبة بشكل مشابه للتسلسلات الموضحة هنا. لاحظ أن قليل النيوكليوتيدات تحتوي على تسلسل محفز T7 RNA polymerase بالإضافة إلى مواقع تقييد طرفية بعد إنهاء قليل النيوكليوتيدات لضمان تكوين نهايات لاصقة.

بعد ذلك، قم بتحضين العينات مع T4 polynucleotide kinase ومحلول T4 polynucleotide kinase buffer لمدة ساعة واحدة عند 37 °C لإضافة مجموعة فوسفات إلى الطرف 5' بمقدار 1 µmol من كل من قليل النوكليوتيد (oligonucleotides). بعد ذلك، قم بتحضين قليل النوكليوتيد الأمامي والعكسي المفسفرة مع T4 DNA ligase buffer لمدة خمس دقائق عند 95 °C على كتلة تسخين. بعد تهجين العينات، قم بإطفاء مصدر الحرارة واترك الخليط ليبرد لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريبًا حتى تصل العينات إلى درجة حرارة الغرفة.

الآن، قم بربط قليلات النوكليوتيد (oligonucleotides) المُحضرة مع مزيج تهجين من ناقل P المهضوم ومنزوع الفوسفات، ومحلول T4 DNA Ligase buffer، وT4 DNA Ligase عند درجة حرارة 16 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، قم بتحويل البلازميدات المربوطة إلى خلايا e coli، DH5α كفؤة باتباع البروتوكولات القياسية، مع استخدام فحص اللون الأزرق والأبيض (blue white screening) لتحديد عمليات الربط الناجحة. وأخيرًا، اعزل البلازميدات وحدد المستنسخات الإيجابية عن طريق الهضم ثم تسلسل البلازميد.

يمكن تصميم تسلسلات قصيرة من ركائز الـ RNA الخاصة بـ cas ذات تكرار أحادي بشكل مشابه لتلك الموضحة هنا. تأكد من إدراج ديوكسي ريبونوكليوتيد. وفي حال الرغبة في تحديد موقع قطع الـ RNA، يمكن حينئذٍ الاستعانة بمرفق تخليق مخصص لتنفيذ إنتاج قليلة النوكليوتيد من الـ RNA.

بعد عزل البلازميدات ذات الركيزة المخصصة المختارة، استخدم طقم تنقية البلازميدات بتركيز عالٍ (maxi prep) لتحويل البلازميدات إلى شكل خطي باستخدام إنزيم القطع الذي يقطع في اتجاه المصب من القطع المستنسخة. بعد ذلك، وبعد التأكد من الهضم الكامل، قم بتنقية البلازميد الخطي عن طريق الاستخلاص بالفينول والكلوروفورم والترسيب بالإيثانول. ثم استعد الأحماض النووية عن طريق إعادة تعليق الراسب في ماء معقم معالج بـ DEPC.

الآن، قم بتحضين البلازميدات الهاضمة في خليط نسخ تدوير T7 RNA polymerase مُحضّر حديثاً في المختبر، والذي يتضمن ATP و CTP و GTP و UTP، لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. وأخيراً، قم بتحليل نسخ الـ RNA الناتجة على هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12% يحتوي على 8 مولار من اليوريا الممسخة. ومن الممكن أيضاً تنقية النسخ عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني Mono Q، ثم استعادة النسخ من خلال ترسيب الإيثانول لكسور الـ RNA وإعادة تعليق الرواسب في ماء معقم معالج بـ DEPC لتحليل الركائز المصممة بواسطة مقايسات الإنزيم القاطع (endonuclease assays)؛ ابدأ بتصوير حزم الركيزة عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي وتنقية نواتج التفاعل عن طريق الاستخلاص من هلام يحتوي على 8 مولار من اليوريا الممسخة.

هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12%، ثم يتم إنتاج وتنقية بروتينات cas المأشوبة المطلوبة عبر الترسيب الحراري، وكروماتوغرافيا النيكل NTA، كما هو موضح لبروتين CAS six من بكتيريا Clostridium thermo cell. بعد ذلك، يتم دمج بروتين CAS مع خليط تفاعل إندونيوكلياز مُعد حديثاً لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح بحدوث تفاعل مقايسة الإندونيوكلياز. وأخيراً، يتم تحميل خمسة ميكرولتر من خليط التفاعل على يوريا بتركيز 8 مولار.

هلام بولي أكريلاميد بتركيز 12% وتصوير نواتج القطع بعد الترحيل الكهربائي عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي. يظهر هنا هلام بولي أكريلاميد مصبوغ بصبغة Coomassie blue لأوليغونوكليوتيد RNA مصمم خصيصاً ونسختين من RNA تم إنتاجهما مختبرياً. يُلاحظ أن كفاءة إنتاج RNA تختلف بين البنى القصيرة والطويلة والمتوسطة الطول.

يتطلب استقصاء نشاط إنزيم RNA endonuclease وجود ضوابط إيجابية وسلبية، بالإضافة إلى بروتينات cas معاد تركيبها وعالية النقاوة. في هذا الشكل: هلام SDS page لتحضير عينة CAS six من Clostridium thermo cell.

يظهر هنا تشغيل كروماتوغرافيا Ni-NTA بجانب علامة بروتينية قياسية بعد الترسيب الحراري. يجب أن تحتوي عينة ضابطة سلبية مناسبة على محلل خلوي لا يعبر عن CAS six، ولكن بعد اتباع إجراء تنقية CAS six المتطابق، تم تحديد أن تحضير CAS six يتمتع بالمستوى العالي المطلوب من النقاء. هنا، يمكن تصور شطر ركيزة تسلسل متكرر معلم في الطرف '5 بواسطة بروتين CAS six من Clostridium thermo cell عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي.

يحتوي كل ممر على ركيزة مُوسومة إشعاعياً، أو RNA بعد الحضن مع بروتين ca six كما تشير علامات الزائد، أو مع محلول منظم كضابط سلبي كما تشير علامات الناقص، أو ركائز طويلة أو ركائز قصيرة مع أو بدون إضافة deoxy ribonucleotide عند الموضع ناقص تسعة، والتي استُخدمت لتسهيل تفاعل الإنزيم القاطع الداخلي (endonuclease). لاحظ غياب انشطار الركائز القصيرة عند تضمين deoxy ribonucleotide في جزيء RNA بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن استخدام نوكليازات CAS six أيضاً كأداة لتوليد جزيئات RNA ناضجة ومحددة بدقة. ويمكن دمج جزيئات RNA هذه في معقدات cascade للحصول على رؤى حول مشاركتها في تداخل الهجمات الفيروسية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وإنتاج ركائز CRISPR es لنوكليازات Cas.

تُعد هذه الركائز المختلفة مفيدة لمعالجة الأسئلة المتعلقة بنضوج واستخدام crispr Es.