تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس أحداث اندماج الخلايا التي تتوسطها بروتينات snare عن طريق التعبير النشط لـ beta galacto. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال التعبير عن بروتينات v و t snare بشكل خارجي على سطح خلايا cost seven. وتتمثل الخطوة التالية من الإجراء في دمج الخلايا التي تعبر عن بروتينات V snare مع تلك التي تعبر عن بروتينات T snare.

يؤدي ذلك إلى اندماج الخلايا بوساطة بروتينات snare والتعبير المنشط لإنزيم beta galacto. وفي النهاية، يتم قياس نشاط beta galacto الناجم عن اندماج الخلايا باستخدام مقياس الطيف الضوئي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مقايسة منطقة SAL المجهرية، في قدرتها على تحليل تركيبات متعددة من بروتينات snare.

من الناحية الكمية، على الرغم من إمكانية تطبيق هذه الطريقة لفهم آلية وتنظيم اندماج الغشاء بوساطة بروتينات snare، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لإجراء دراسات ذات إنتاجية عالية. سيقوم بتقديم الإجراء كل من د. ندى حسن، باحثة ما بعد الدكتوراه، وديفيد همفري، فني من مختبري، في اليوم الذي يسبق تحميل عملية عفن الخلية (transfection).

أطباق ذات 24 بئرًا تحتوي على شرائح تغطية زجاجية بقطر 12 مليمتر؛ يتم تجهيز بئرين لكل مجموعة من الخلايا التي تعبر عن بلازميدات فريدة في التجربة على هذه الشرائح. يتم استزراع 30,000 من خلايا cost seven المستزرعة في وسط DMEM مكمل بـ 4.5 جرام لكل لتر من الجلوكوز و10% FBS للترنسفكشن. وبالنسبة لخلايا V، يُضاف إلى كل بئر ربع ميكروجرام من بلازميد TTA ومجموعة واحدة من بلازميدات التعبير.

لترانسفكشن خلايا T بالبروتينات المستهدفة المعكوسة، والتي هي في هذه الحالة vamps المعكوسة، أضف 0.25 µg من البلازميد الذي يشفر TRE lacks Z، والمجموعة المكملة من البلازميدات التي تشفر البروتينات المستهدفة المعكوسة، وهي في هذه الحالة snap 25 وsyntaxin one وsyntaxin four. الآن قم بعملية الترانسفكشن لخلايا cost seven باستخدام lipectomy وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، واستنبت الخلايا لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة من الترانسفكشن، قم بتثبيت الخلايا في para formaldehyde مدعم لمدة 10 دقائق، وبعد التثبيت، اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS++، ثم قم بحجب الخلايا باستخدام FBS مدعم لمدة 30 دقيقة.

بعد عملية الحجب، يتم تحضين الخلايا مع الجسم المضاد أحادي النسيلة anti mic. Nine E 10 لمدة 30 دقيقة، وبعد أربع عمليات غسل باستخدام PBS ++، تُحضن الخلايا لمدة ساعة مع أجسام مضادة ثانوية مرتبطة بـ fitzy بتخفيف 1:500. وبعد أربع عمليات غسل أخرى باستخدام PBS ++، يتم تثبيت الخلايا الموصومة في كاشف anti fade متاح تجارياً.

الخلايا الآن جاهزة للفحص بالمجهر البؤري؛ في اليوم السابق لعملية التعداء، يتم استزراع 1.2 مليون من خلايا cos-7 في كل طبق زراعة أنسجة مقاس 100 مليمتر، و200,000 من خلايا cos-7 في كل بئر من أطباق الستة آبار لكل توليفة بلازميدات سيتم تحليلها. قم بتحضير بئر واحدة، واترك الخلايا في المزرعة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، أضف البلازميدات من أجل عملية التعداء؛ وبالنسبة لخلايا V، يتم تعداء بلازميد يعبر عن بروتين flipped المطلوب و5 µg من p tet off إلى الخلايا في كل مزرعة مقاس 100 مليمتر.

قم بنقل الخلايا الضابطة (control cells) التي لم يتم ترانسفكشنها إلى طبق زراعة بقطر 100 مليمتر مع ناقل فارغ (empty vector) و P te off بنفس التركيزات النسبية المستخدمة في خلايا V. بعد إضافة جميع البلازميدات إلى خلايا V والخلايا الضابطة، أضف tcom mycin إلى تلك الآبار لمنع عملية N glycosylation لبروتينات vamps. في كل بئر من أطباق الست آبار، قم بترانسفكشن خلايا T باستخدام 1 ميكروجرام من PBIG مع البلازميدات المتممة التي تعبر عن البروتينات محل الاهتمام.

قم الآن بنقل الجينات إلى خلايا cost seven باستخدام lip وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة، وبعد مرور 24 ساعة على عملية نقل الجينات، يتم فصل خلايا V عن أطباق الاستزراع باستخدام محلول تفكيك الخلايا الخالي من الإنزيمات. ابدأ بغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 20 milliliters من PBS.

أضف بعد ذلك خمسة ملليلتر من منظم تفكك خالٍ من الإنزيمات. بعد تحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ستنفصل الخلايا عن طريق النقر بقوة على الطبق؛ وتحقق من انفصالها تحت المجهر. إذا انفصل أقل من نصف الخلايا، انتظر خمس دقائق أخرى وانقر على الطبق مرة أخرى.

استمر في التحضين في محلول الفصل (detachment buffer) حتى تنفصل أكثر من نصف الخلايا. بعد ذلك، قم بعدّ خلايا V باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer). ثم أعد تعليق خلايا V بتركيز يبلغ حوالي 480,000 خلية لكل مليلتر في محلول DMEM المنظم المكمل.

أضف الآن 1 mL من خلايا V المعلقة مجددًا إلى كل بئر يحتوي على خلايا T، ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة. وبعد ست أو 12 أو 24 ساعة من الزراعة المشتركة للخلايا، اغسلها باستخدام PBS وأضف محلول التحلل (lysis buffer). بعد ذلك، اكشط الخلايا من الآبار وانقلها إلى أنابيب لإجراء عملية الطرد المركزي.

بعد عملية الطرد المركزي، انقل الراشح إلى أنبوب جديد وقم بقياس تعبير beta galacto باستخدام مقايسة متاحة تجارياً وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة؛ وخلال ذلك البروتوكول، تأكد من إيقاف تفاعل cholera metric بعد 90 دقيقة بإضافة sodium carbonate بتركيز one molar لتسجيل النتائج. قم بقياس الامتصاصية عند 420 nanometers باستخدام spectrophotometer. وعندما تم ترانسفكشن خلايا CO seven بـ flipped snare plasmids، تم تعبير flipped snare proteins على سطح الخلية.

استُخدم قياس التدفق الخلوي لقياس مستويات تعبير بروتينات snare على سطح الخلية. ومن أجل مقارنة قدراتها على الاندماج الغشائي، كان من الضروري التعبير عن vamps بنفس المستوى. وبناءً على ذلك، تم معايرة تركيز كل بلازميد snare مقلوب مُستخدم في عملية عفن الخلية (transfection) وتحسينه لضمان كفاءة عملية العفن.

في ظل هذه الظروف، تم التعبير عن vamps 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 و syntaxin 1 و 4 بنفس المستوى على سطح الخلية على التوالي، وقد استُخدمت بروتينات snares العصبية التي تتوسط عملية الإخراج الخلوي التشابكي لاختبار جدوى المقايسة. وبالفعل، عند دمج خلايا V التي تعبر عن vamp 2 وخلايا T التي تعبر عن SYNTAXIN 1 و snap 25، تم اكتشاف تعبير قوي لـ beta galacto. ومع ذلك، عندما لم يتم التعبير عن vamp 2 أو SNAP 25، تم اكتشاف نشاط beta galacto sase الأساسي فقط، مما يشير إلى أن اندماج الخلايا والتعبير عن beta galacto sase يعتمدان على التفاعلات بين v و t snares بشكل عام؛ وقد أظهر كل من SYNTAXIN 1 و snap 25 و vamp 1 و vamp 3 و vamp 8 أنشطة اندماج متقاربة وكانت هي الأعلى.

وفي المقابل، يشير نشاط beta GAL الأساسي إلى أن مزيج البروتينات لا يحفز اندماج الغشاء، كما هو الحال بين vamp five و SYNTAXIN one و Snap 25. وأثناء إجراء مقايسة الاندماج الإنزيمي، من المهم تذكر إضافة unica mycin لمنع عملية glycosylation لبروتينات esna، وإضافة DTT لمنع تكوين الروابط ثنائية الكبريتيد بين بروتينات esna.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسة دمج الخلايا.