ال الليمونية rodentium نموذج الفأر: دراسة العوامل الممرضة والمضيفة المساهمات في التهاب القولون المعدية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث التهاب القولون عن طريق إصابة الفئران بممرض النسخ المتطابق سالب الجرام ، قوارض الستروباكتر ، مما يسمح بدراسة تفاعلات مسببات الأمراض والمضيف في الجهاز الهضمي. يتم تحقيق ذلك من خلال التلقيح الأول ، وهي ثقافة الاسترداد الصفري بين عشية وضحاها. في الخطوة الثانية ، تصاب الفئران بالتزقيم الفموي باللقاح الليلي.

بعد اليوم السابع بعد الإصابة ، يتم جمع القولون الأعور والمحتويات اللمعوية خلال الخطوة النهائية. يتم طلاء الأنسجة ، ويتم حساب المستعمرات البكتيرية ، والأنسجة هي صبغة مناعية للبروتينات المضيفة ذات الأهمية. في النهاية ، يمكن تقييم عبء العامل الممرض ووظيفة الحاجز والضرر النسيجي والتغيرات في استجابة المضيف من خلال الكيمياء المناعية.

على الرغم من أن هذه الطريقة تقدم نموذجا قويا لالتهاب القولون المعدي ، مما يسمح بدراسة تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة والاستجابات المناعية ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفها لفحص آثار العدوى البكتيرية على خطر الإصابة بسرطان القولون. بشكل عام في الأفراد الجدد على هذه الطريقة من شأنها أن تكافح بشكل طبيعي مع العدوى البكتيرية للفئران ، مع أو مع أو مع, أو القياس. ابدأ باستخدام حلقة تلقيح معقمة لاسترداد C القابل للتطبيق من مخزون الجلسرين المجمد على صفيحة كهربائية LB.

بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية ، استخدم حلقة تلقيح لنقل المستعمرات من لوحة LB إلى ثلاثة ملليلتر من مرق رطل معقم. بعد ذلك ، احتضن ثقافة ERO Dunum هوائية في شاكر حضانة على الطاولة عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، يجب أن يبدو مرق رطل الملقح غائما.

حرك المزرعة برفق لتوزيع ثقافة الخلايا البكتيرية بالتساوي ، ثم قم بتحميل حقنة سعة ملليلتر واحد بالمرق وإرفاقها بإبرة تزقيم المعدة. حدد فأرة للتزقيم عن طريق الإمساك بالجلد المترهل بإحكام على رقبته وظهره باستخدام الأنثى والأصابع. ثم اسحب رأس للخلف بإصبع السبابة لشل حركة رأس وتصويب المريء لإدخاله.

حافظ على الفأر في وضع رأسي ، وقم بتوجيه طرف المصباح لإبرة تزقيم المعدة على طول جانب فم وفوق لسانه. مرر الإبرة برفق على طول سقف فم وقم بدفع الإبرة إلى أسفل المريء. أخيرا ، استخدم المحقنة لحقن 100 ميكرولتر من اللقاح البكتيري ببطء ، ثم قم بإزالة إبرة التزقيم برفق.

راقب معدل تنفس الفأر وسلوكه بعد إعادته ، قفصه في يوم الفحص ، قم بتقطيع الفأر كما هو موضح للتو ، ثم قم بتجعيد ب 150 ميكرولتر من دكسترين فيتزي المحضر حديثا. اسحب الطعام من القفص في هذا الوقت ، بعد أربع ساعات من التزقيم ، ثم تخدير. استخدم ثقب القلب لجمع أكبر قدر ممكن من الدم من المخدر.

أضف الدم إلى التركيز النهائي 3٪ من سكر العنب الحمضي سيترات في أنبوب طرد مركزي دقيق لردع التخثر. بعد ذلك ، قم بتدوير عينات الدم لمدة 12 دقيقة عند 1000 جبن وأربع درجات مئوية. ثم اجمع المصل وقم بتخزينه إلى واحد إلى 10 وواحد إلى 100 في PBS عند 100 ميكرولتر من كل عينة.

في هذين التخفيف إلى 96 لوحة بئر في نسخة. لتحضير المنحنى القياسي ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من عينات 80 ملليغرام الأصلية لكل ملليلتر. اعتاد فيتز دكسترين على تقليص الفئران في PBS في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الداكنة.

ثم أضف العينات القياسية إلى لوحة 96 بئر في ثلاث نسخ. ثم استخدم مقياس الفلور لتحديد كمية مضان كل عينة ولتحديد تركيز دكسترين FXI باستخدام تقنية معقمة ، ابدأ هذه الخطوة بإضافة مليلتر واحد من PBS المعقم وحبة معدنية من الأوتوكلاف لتقريب القاع إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي ملليلتر. ثم قم بوزن كل أنبوب.

بعد ذلك ، بعد إزالة المصل والقولون من الفأر ، افصل المصل عن القولون واقطعه طوليا. اجمع المحتويات اللمعية باستخدام ملقط وأضف المحتويات إلى أنبوب PBS. اغسل التكملة وأنسجة القولون باستخدام PBS معقم قبل وضعها في أنابيب منفصلة.

الآن قم بوزن أنابيب الأنسجة وقم بتجانس العينات باستخدام مضرب الخرز لمدة ست دقائق. عند 30 هرتز ، أضف 180 ميكرولترا من PBS المعقم لكل بئر إلى لوحة 96 بئر. ثم أضف 20 ميكرولترا من كل عينة متجانسة إلى البئر الأول في كل صف واخلطها جيدا.

قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من كل بئر سابق للحصول على التخفيف من 10 إلى ناقص واحد في البئر الأول وصولا إلى 10 إلى سالب ستة. ثم قم بوضع 10 ميكرولتر من كل تخفيف من كل عينة في ثلاث نسخ على صفيحة LB مربعة القاع مع شبكة بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. عد وحدات تشكيل المستعمرة على لوحة واحدة.

متوسط التكرارات الثلاثية لكل عينة ، ثم سجل التخفيف الذي تم فيه حساب كل عينة. اضرب متوسط CFU في 50 وعامل التخفيف الذي تم فيه حساب العينة ، مما أدى إلى CFUs لكل مليلتر. أخيرا ، قسمها على وزن الأنسجة لتحديد CFUs لكل جرام بعد عشية وضحاها ، رسميا وتثبيت قسم القولون والجزء العلوي المحفوظ مسبقا 0.5 سنتيمتر.

في صباح اليوم التالي ، اغسل المناديل بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها في كاسيت لإرسالها إلى منشأة الأنسجة ليتم تضمينها في البارافين وتلطيخها بالهيماتين واليوزين لإزالة الأنسجة من الأنسجة ضع الشرائح في وعاء تلطيخ مشترك في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن ، ضع الشرائح في الزيلين لمدة أربع غسلات مدة كل منها دقيقتان.

يعيد كل منها ترطيب الشرائح بغسلتين لمدة خمس دقائق و 100٪ إيثانول ، متبوعا بغسل لمدة خمس دقائق في كل مما يلي. 95٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول وماء مقطر. ضع الشرائح المغسولة في وعاء مشترك مع مخزن مؤقت لسترات الصوديوم الدافئ مسبقا ، ثم ضع البرطمان في قدر بخاري لمدة 30 دقيقة بعد ترك البرطمان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS Zied لمدة خمس دقائق.

عندما تجف الشرائح ، ضع علامة على المنطقة المحيطة بالأنسجة بقلم عنق الرحم. ثم قم بسد الأنسجة بمحلول مانع في غرفة رطوبة تلطيخ المناعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، اسكب المخزن المؤقت المانع واحتضان الأنسجة في 50 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

بعد فترة الحضانة ، اغسل المناديل ثلاث مرات باستخدام PBS Azi لمدة خمس دقائق. ثم احتضان الشرائح في 50 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي في الظلام في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات بالماء المقطر لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتجفيف الأنسجة ، وقم بتغطية الشرائح بوسط تثبيت ذهبي طويل الأمد ، ثم قم بتطبيق زلة غطاء عرضت على الشرائح تحت المجهر الفلوري.

يوضح هذا الشكل الأول أن فيتز دكسترين تم قياسه في مصل C 57 Black Six Mess ، وكذلك من المستقبلات الشبيهة بالحصيلة إلى الفئران بالضربة القاضية ، والتي وجد سابقا أنها تظهر ضعف في سلامة الحاجز الظهاري أثناء الإصابة في وجود حاجز ظهاري معوي سليم. دكسترين ZI ضعيف الاختراق من خلال هذه الطبقة. لذلك ، تشير المستويات المتزايدة من فيتز دكسترين في المصل إلى ضعف في سلامة الحاجز الظهاري المعوي أثناء الإصابة ، مما يسمح لهذا الجزيء بالتسرب كمستويات مصل تحكم في الفئران غير المصابة.

يتم تقديم Gavage مع Fitz dextrin. الموافقة هي مسببات الأمراض اللمعية التي يمكن أن تلتصق بشكل وثيق بالخلايا الظهارية المعوية. يمكن أن تكون الأحمال البكتيرية في المحتويات اللمعية والتكملة وأنسجة القولون في اليوم السابع. ما بعد العدوى.

تم العثور على الأحمال البكتيرية في القولون لذروتها حوالي 10 إلى CFU التاسع لكل جرام. تحدث معظم الأمراض التي لوحظت أثناء عدوى C DUM في C 57 PL ستة فئران في السنتيمترين البعيدين من القولون مجهريا بحلول اليوم السابع بعد الإصابة. لوحظ سماكة الغشاء المخاطي للقولون ، وكذلك تقصير القولون وطوله بشكل طبيعي أثناء الإصابة.

C 57 PL ستة فئران تعاني فقط من التهاب معتدل وأمراض كما يتميز من الناحية النسيجية بتسلل الخلايا المناعية واستطالة الخبايا القولونية واستنفاد خلايا الجماع. لتوصيف استجابات المضيف التي تم تركيبها أثناء الإصابة بالخلاص الصفري ، يمكن استخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي لفحص التغيرات في البروتينات ذات الأهمية ، مثل علامات الانتشار ، أو في فحص جوانب الاستجابة البكتيرية مثل توطينها داخل الأنسجة المصابة. مثال على تقنية التلوين هذه ، فحص البروتين المضيف KI 67 ، وهي علامة لتكاثر الخلايا التي تظهر باللون الأحمر وتمزق البروتين الصفري ، والذي يظهر باللون الأخضر لفحص توطين البكتيريا في اليوم 12 بعد الإصابة موضح في هذا الشكل.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يتم تنفيذ تقنية القياس بشكل صحيح للتأكد من إصابة الفئران ومراقبة صحة طوال فترة العدوى. على مدى السنوات ال 10 إلى ال 15 الماضية ، أصبح نموذج القوارض citrobacter هو المعيار الذهبي لدراسة ربط مسببات الأمراض البكتيرية المواجهة مثل epec في هيك.

علاوة على ذلك ، فقد أصبح نموذجا معترفا به جيدا لدراسة الاستجابات المناعية المخاطية للبكتيريا ، مثل تطوير استجابات TH 17 داخل القناة الهضمية.