جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم المناعة المضادة للأورام للقاح الخلايا الشجيرية (DC) القائم على الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) في مضيف يتمتع بكفاءة مناعية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) التي تتميز بنشاط عالٍ لإنزيم ألدهيد ديهيدروجيناز (ALDH high) من خلايا ورمية غير متجانسة. وفي الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا الشجيرية المشتقة من الخلايا الجذعية السرطانية (CSC dcs) ثم تحفيزها باستخدام مستخلص خلوي (lysate) لإعداد اللقاح.

بعد ذلك، يتم إعطاء لقاح الخلايا التغصنية (DC) النبضية بمحلل الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) أو لقاح TP DC للمضيفات المتوافقة جينياً وسوية المناعة. ثم في الخطوة النهائية، يتم تقييم الفعالية الواقية المضادة للأورام للقاح C-S-C-T-P-D-C. وفي الختام، يمكن إجراء تحليل ELI SA لتقييم المناعة المضادة للخلايا الجذعية السرطانية (CSC) التي يحفزها لقاح C-S-C-T-P-D-C بواسطة الخلايا التائية والأجسام المضادة للمضيف.

يجمع هذا المشروع بين اثنين من أكثر المجالات إثارة في أبحاث السرطان، وهما مجال الخلايا الجذعية السرطانية ومجال العلاج المناعي للأورام. كان مختبرنا من بين الأوائل الذين اكتشفوا الخلايا الجذعية السرطانية في الأورام الصلبة، وهي بمثابة بذور السرطان التي تدفع نموه وكذلك انتشاره.

ما ستشاهده اليوم هو نهج جديد يستخدم العلاج المناعي لاستهداف هذه الخلايا الجذعية السرطانية بشكل محدد. نحن نستخدم علامة معينة تسمى aldehyde dehydrogenase، والتي يمكن اكتشافها بواسطة مقايسة Alde fluoro. سترى الطبيبين Lin Liu و Huon Tau يعملان جنباً إلى جنب مع Dr.Chow Lee.

نأمل من خلال استهداف هذه الخلايا الجذعية السرطانية أن نتمكن من تحسين النتائج للمرضى المصابين بأنواع عديدة من السرطان. ابدأ بتعليق الخلايا الورمية المطلوبة في محلول منظم ALOR بتركيز 1×10⁶ خلية/مل. بعد ذلك، انقل جميع الخلايا الورمية باستثناء 3 مل إلى كل أنبوب من أنابيب العينات، وقم بتسمية أربعة أنابيب اختبار بوليسترين مقاس 12×75 ملم كأنابيب تحكم على النحو التالي: غير مصبوغة (unstained)، وALOR، وALOR plus DEAB، و7-AAD. قم بتوزيع 1 مل من معلق الخلايا في الأنابيب غير المصبوغة وأنابيب 7-AAD، و2 مل في أنبوب ALOR.

بعد ذلك، أضف 5 µL من DEAB إلى أنبوب ALOR plus DEAB. ضع الأنابيب على الثلج، ثم امزج 10 µL من ركيزة alor المنشطة في أنبوب alor. انقل فوراً 1 mL من محلول الركيزة إلى أنبوب ALOR plus DEAB، ثم أضف 2 µL من ركيزة alor المنشطة لكل 1 مليون خلية إلى كل أنبوب من أنابيب العينات.

قم بتحضين جميع الأنابيب في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة، ثم أضف 5 µL من 7-AAD إلى أنبوب 7-AAD و 1 µL من 7-AAD لكل 1 مليون خلية في كل أنبوب عينة. احفظ هذه الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. قم بطرد مركزي لجميع الأنابيب لمدة خمس دقائق بسرعة 250 ×g في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الرواسب في AldeFluor assay buffer لإجراء عملية فرز الخلايا المنشطة بالفلورية.

لضبط بوابات الفرز، استخدم خلايا alde Fluor plus DEAB كعنصر تحكم سلبي، وخلايا seven A a D المصبوغة كعنصر تحكم في الحيوية. وبناءً على عناصر التحكم هذه، قم بإنشاء بوابة لتمييز خلايا alor positive A LDH و high D five و SCC seven. ثم استخدم ذلك لفرز خلايا العينة إلى مجموعات alor positive A LDH و high D five و SCC seven.

لتوليد الخلايا الشجرية، ابدأ بعزل عظمتي الفخذ والظنبوب من فأر C 57 black six وفأر C3 H. عقم العظام في 75% ethanol لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها باستخدام HBSS. بعد ذلك، اقطع أطراف العظام، ثم استخدم سرنجة سعة 10 milliliter مزودة بإبرة مقاس 21 gauge لدفع نخاع العظم في طبق بتري، وقم بسحب الخلايا وتوزيعها عدة مرات لإنشاء معلق من الخلايا المفردة، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً.

يُحضن الراسب في 5 mL من محلول تحلل كريات الدم الحمراء لمدة دقيقة واحدة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. وبعد عد الخلايا، يتم ضبط الحجم ليصل إلى 1×10⁶ خلية/mL في وسط استزراع مضاف إليه G-M-C-S-F وIL-4. ثم تُستزرع الخلايا عند درجة حرارة 37 °C و5% CO2، مع تجديد الوسط والسايتوكينات بعد ثلاثة أيام.

في اليوم الخامس، يتم حصاد الخلايا التغصنية غير الناضجة. بعد تدوير الخلايا، أعد تعليق الرواسب في خمسة مليلتر من وسط الزرع، ثم قم بإضافة معلق الخلايا ببطء على شكل طبقة فوق وسط عزل تم تحضيره حديثاً. بعد طرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، اجمع الخلايا التغصنية الموجودة بين طبقتي وسط الزرع ووسط العزل.

بعد ذلك، وبعد عد الخلايا، اضبط الحجم للوصول إلى تركيز 1 × 10⁶ خلية لكل milliliter في وسط استزراع مضاف إليه G-M-C-S-F و IL-4. قم الآن بإعداد نواتج تحلل الأورام (tumor lysates) عن طريق تعريض الخلايا المفروزة لدورات سريعة من التجميد والإذابة أربع مرات، يتبع ذلك عملية طرد مركزي لجمع الجزء الغشائي من نواتج التحلل. بعد ذلك، قم بتحفيز DCS باستخدام نواتج التحلل المستخلصة من الخلايا الذاتية المفروزة ذات التعبير العالي عن ALDH، وذلك لتحضير CSC TPCs.

لتحضير نبضة H-T-P-D-C، يتم تلقيح حيوانات الاستقبال التجريبية عن طريق حقن 1×10⁶ من الخلايا المنبضة، والمعلقة في 100 µL من PBS، تحت الجلد في الجانب الأيسر من كل فأر باستخدام dcs مع مستخلص خلايا ورمية غير مصنفة. بعد التلقيح، يتم حقن 1×10⁵ من خلايا ورم D5 غير متجانسة في 100 µL من PBS وريدياً لتحفيز الاستجابة في فئران الاستقبال C57BL/6. أما بالنسبة لنموذج SCC7، فيتم تحفيز فئران الاستقبال C3H عن طريق حقن 1×10⁶ من خلايا ورم SCC7 غير مصنفة في 100 µL من PBS تحت الجلد في الجانب المقابل لموضع لقاح DC.

قم بإعداد معلق خلوي أحادي من طحال فئران C3 H المستلمة. بعد ذلك، قم بتنشيط الخلايا التائية والخلايا البائية الطحالية باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة مثبتة لـ anti CD three و anti CD 28 في وسط استزراع مضاف إليه المحفز المناسب. بعد أربعة أيام، اجمع الرواشح ثم قم بطلاء أطباق ELISA بأجسام مضادة ضد interferon gamma أو G-M-C-S-F أو IgG عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. في اليوم التالي، قم بحجب الارتباط غير النوعي في الطبق، ثم أضف المعايير والرواشح التي تم جمعها للتو، وبعد ذلك قم بحضن الأطباق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل، أضف الجسم المضاد الكاشف HRP لمدة ساعة واحدة، ثم أضف ركيزة TMB.

أخيراً، قم بقياس الامتصاصية باستخدام قارئ أطباق ELISA عند 450 نانومتر خلال 30 دقيقة من إيقاف التفاعل. لقد استُخدم Alor كعلامة لعزل الخلايا الجذعية في عدة أورام خبيثة، بما في ذلك المجموعتين المغلبتين بالخلايا الجذعية السرطانية D five و SCC seven؛ وكما هو موضح تحديداً في هذه المخططات النقطية، تساهم الخلايا الموجبة لـ alor بنسبة 0.5% و 5.2% تقريباً من خطوط خلايا أورام D five و SCC seven المستنبتة على التوالي. كما تم تحديد أن الخلايا الورمية التي تم حصادها حديثاً تحتوي على 2.5% و 4.2% من الخلايا الموجبة لـ alor من أورام D five و SCC seven التي تم إنشاؤها داخل الجسم الحي على التوالي.

استُخدمت الخلايا الورمية المعالجة بمثبط LDH المحدد D-E-A-B-A كضابط سلبي. وتم تقييم القدرة المناعية للخلايا الجذعية السرطانية من خلال فحص المناعة الواقية المضادة للأورام التي حفزتها TPCs الخاصة بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC TPCs) باستخدام نموذج التطعيم الذي تم توضيحه للتو. وكما يظهر في هذا الجدول، فإن الفئران المعالجة بـ H TPCs أظهرت عدداً أقل من النقائل الرئوية مقارنة بالفئران المعالجة بمحلول PBS وحده.

ومن الأهمية بمكان أن الفئران التي عولجت بـ CSCT PCs أظهرت عدداً أقل من النقائل الرئوية مقارنة بالحيوانات التي عولجت بـ H-T-P-D-C أو PBS وحده. وفي نموذج SCC seven، تم تطعيم حيوانات C3 H الطبيعية كما تم توضيحه للتو مقارنة بمجموعة الضبط. وقد حفزت H TPCs مناعة متواضعة مضادة للأورام، بينما حفزت CSC TPCs تثبيطاً ملحوظاً لنمو الورم. وتشير هذه النتائج إلى أن CSCs قد تكون صالحة للاستخدام كمصدر مستضد أكثر فعالية لتحميل dcs من الخلايا الورمية التقليدية غير المفروزة لتحفيز مناعة واقية ضد تحدي الخلايا الورمية.

لفهم الآليات الكامنة وراء المناعة المضادة للأورام الواقية التي حفزتها الخلايا الجذعية السرطانية (CSC)، تم تنشيط الخلايا من الحيوانات التي تم تطعيمها بالخلايا التغصنية (DC) وقياس إنتاجها من السيتوكينات بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وكما تم توضيحه للتو، كان هناك إنتاج أعلى بكثير من السيتوكينات بواسطة الخلايا التي تم جمعها من الحيوانات الملقحة بـ D five CSC TPCs، أو S CCC seven CSC PCs، مقارنة بتلك التي تم جمعها من الحيوانات الملقحة بـ D five H TPCs أو SCC seven HTCs. لقد رأيتم اليوم كيفية استخدام مقايسة Alor لعزل الخلايا الجذعية السرطانية.

ويمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا الجذعية السرطانية لتطوير علاجات مناعية تعتمد على الخلايا التغصنية. ونأمل أن تؤدي هذه العلاجات المناعية، سواء استُخدمت بمفردها أو بالاشتراك مع العلاجات الحالية، إلى تحسين التوقعات المرضية للمصابين بأنواع عديدة من السرطان.