جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد وهم وسادة دهنية في العقدة الليمفاوية لتقييم مساهمة الأنسجة الدهنية في تكوين سدى الغدد الليمفاوية. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق عزل الغدد الليمفاوية من الفئران حديثي الولادة والوسادات الدهنية من أجنة الفئران في اليوم 18.5. تتم إزالة العقدة الليمفاوية من وسادة الدهون الجنينية واستبدالها بالعقدة الليمفاوية لحديثي الولادة.

يتم تجميع وهم وسادة دهنية العقدة الليمفاوية عن طريق إعادة ربط ثم زراعة عقدة ليمفاوية حديثي الولادة مع وسادة دهنية جنينية واحدة في المختبر. ثم يتم تطعيم الوهم تحت كبسولة الكلى للفأر المضيف. بعد ثلاثة أسابيع من الزرع ، يتم حصاد الكلية واسترداد الوهم.

في النهاية ، يمكن تقييم مساهمة الخلايا المشتقة من الوسادة الدهنية في سدى العقدة الليمفاوية عن طريق التحليل المجهري للتدفق الخلوي والتألق المناعي. لذلك خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نبحث عن طريقة لتقييم ما إذا كانت الخلايا من الوسادة الدهنية تساهم في تكوين الغدد الليمفاوية لعزل الغدد الليمفاوية الأربية لحديثي الولادة. بعد تقطيع الرأس ، استخدم مقصا لفتح جسم من أعلى المنطقة الصدرية إلى أسفل البطن.

بعد إزالة جميع الأحشاء بعناية من تجويف البطن ، ضع الجسم في طبق بتري 90 ملم يحتوي على وسائط RF 10. ضع الطبق في غطاء معقم لزراعة الأنسجة ثم انقل الجسم إلى طبق بتري معقم جديد مقاس 90 ملم يحتوي على RF 10 الطازج. ثم افصل الصفاق بعناية عن الجلد في المنطقة الأربية وحدد موقع الغدد الليمفاوية الأربية الموجودة عند تقاطع ثلاثة أوعية دموية في الوسادة الدهنية.

قم بإزالة الغدد الليمفاوية بعناية ، وتأكد من إزالة جميع الأنسجة الدهنية. ثم ضع الغدد الليمفاوية في طبق بتري مقاس 50 ملم يحتوي على وسائط RF 10 على الجليد لعزل ضمادات الدهون الأربية من أجنة اليوم 18.5. بعد إزالة الأحشاء كما هو موضح للتو ، اغسل الجثث في PBS معقم للتخلص من جميع آثار الدم.

انقل الأجسام التي تم تنظيفها إلى طبق بتري جديد مقاس 90 ملم ثم افصل الصفاق ، وقم بتحديد موقع العقدة الليمفاوية الأربية وإزالتها كما هو موضح للتو. تخلص من الأنسجة المعزولة. احرص على إزالة العقدة الليمفاوية بأكملها لتجنب تلوث وهم الوسادة الدهنية.

ثم قم بإزالة وسادة الدهون الأربية وضعها في طبق بتري مقاس 50 ملم يحتوي على وسائط RF 10 على الثلج. لإعداد نظام زراعة الأعضاء في المختبر ، قم أولا بتقطيع بعض فولكان إلى قطعة واحدة إلى 1.5 سم مربع. ثم اغلي الإسفنج لمدة ساعتين والمرشحات لمدة 20 دقيقة في ماء مقطر واتركيها تجف لعدة ساعات في غطاء زراعة الخلايا.

بمجرد أن تجف المواد ، ضع إسفنجة واحدة في طبق بتري سعة 50 ملم يحتوي على ملليلترين من الوسائط. اغمر كل إسفنجة في الوسائط لترطيب كلا الجانبين ، ثم ضع مرشحا واحدا لكل نظام زراعة الأعضاء في المختبر في واجهة الهواء السائل. بعد ذلك ، أعد ربط وسادة دهنية جنينية واحدة بعناية بعقدة ليمفاوية واحدة لحديثي الولادة مباشرة في الجزء العلوي من كل مرشح.

انقل أطباق بتري إلى صندوق بلاستيكي مستطيل به ماء في الأسفل وفتحات في الغطاء. ألصق الغطاء على الصندوق واترك الثقوب مفتوحة. ثم ضع الصندوق في حاضنة ثقافة خلايا CO2 بدرجة حرارة 37 درجة مئوية 5٪.

اترك الصندوق يتوازن لمدة ساعتين ثم أغلق الثقوب الموجودة في الغطاء بشريط لاصق. احتضان الأنسجة لمدة يومين على الأقل للسماح للغدد الليمفاوية بالالتصاق بالوسادات الدهنية قبل نقلها تحت كبسولة الكلى ، بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من الزرع. اعزل كل وهم وسادة دهنية في العقدة الليمفاوية داخل كل كلية وتشريح الغدد الليمفاوية.

ثم لكل عقدة ليمفاوية ، استخدم مقصا صغيرا لعمل شق واحد في الأنسجة للمساعدة في الهضم الأنزيمي. بعد ذلك ، ضع عقدة ليمفاوية واحدة في كل منها في أنابيب einor فردية سعة 1.5 ملليلتر تحتوي على 600 ميكرولتر من عازلة الهضم. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية مثيرة ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل كل 10 دقائق للمساعدة في فصل الأنسجة.

ثم أضف ستة ميكرولترات من EDTA إلى الأنابيب وقم بتقطيع تعليق الخلية عدة مرات لإنهاء التفكك. يمكن بعد ذلك تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة المرغوبة ذات الأهمية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للحفاظ على البروتين الفلوري الأصفر المحسن أو تعبير EYFP. إصلاح الغدد الليمفاوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات.

ثم لكل عقدة ليمفاوية ، ضع قطرة واحدة من مركب OCT البارد على قطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم. تجنب فقاعات الهواء ، ضع عقدة ليمفاوية واحدة بعناية في منتصف كل قطرة ثم ضع ورق القصدير على الثلج الجاف لتجميد الأنسجة. يمكن بعد ذلك تقطيع الغدد الليمفاوية وتلطيخها وتحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري.

P يسمح العزل الدقيق للعقدة الليمفاوية بمزيد من التحليل لذرية الخلايا المشتقة من الدهون الإيجابية EYFP. تكشف أقسام التبريد وتحليل الفلورسنت المناعي للعقدة الليمفاوية أن الخلايا المشتقة من الدهون الإيجابية EYFP تهاجر إلى العقدة الليمفاوية حيث تساهم في GP 38 إيجابي E RTR سبعة تدفق إيجابي لشبكة الخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية يؤكد تحليل القياس الخلوي أن جزءا مهما من الخلايا اللحمية للعقدة الليمفاوية مشتق من الخلايا السلفية للأنسجة الدهنية الإيجابية EYFP المحلية التي تساهم في 30٪ من CD 45 سالب G 38 إيجابي CD 31 FIBROBLASTIC جزء ، و 10٪ من CD 45 سلبي GP 38 سلبي CD 31 جزء الخلايا البطانية الدموية الإيجابي يصل إلى 80٪ من CD 45 ، يمكن اشتقاق الجزء الليفي الليفي السلبي G 38 الإيجابي CD 31 من خلايا سلائف الأنسجة الدهنية مما يدل على الدور الحاسم الذي تلعبه الأنسجة الدهنية في الحفاظ على نمو سدى العقدة الليمفاوية. لذلك بمجرد إتقانها هذه التقنية مع باحث في مجال تكوين الأعضاء اللمفاوية لاستكشاف دور الجزيئات المختلفة المشاركة في صدمة اللمفاوية.