جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء كيميرا من وسادة دهنية وعقدة لمفاوية لتقييم مساهمة النسيج الدهني في تكوين سدى العقد اللمفاوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل العقد اللمفاوية من الفئران حديثة الولادة والوسادات الدهنية من أجنة الفئران في اليوم 18.5. يتم إزالة العقدة اللمفاوية من الوسادة الدهنية الجنينية واستبدالها بالعقدة اللمفاوية من الفأر حديث الولادة.

يتم تكوين خيمرة وسادة الدهون في العقدة اللمفاوية عن طريق إعادة تجميع ثم زراعة عقدة لمفاوية واحدة لحديث الولادة مع وسادة دهنية جنينية واحدة في المختبر (in vitro). بعد ذلك، تُطعّم الخيمرة تحت كبسولة الكلية لفأر مضيف. وبعد ثلاثة أسابيع من الزرع، يتم استئصال الكلية واستعادة الخيمرة.

في النهاية، يمكن تقييم مساهمة الخلايا المشتقة من الوسادة الدهنية في سدى العقدة اللمفاوية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي والتحليل المجهري للفحص المناعي الفلوري. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نبحث عن وسيلة لتقييم ما إذا كانت الخلايا القادمة من الوسادة الدهنية تساهم في تكوين العقد اللمفاوية. لعزل العقد اللمفاوية الإربية لحديثي الولادة، وبعد فصل الرأس، استخدم مقصاً لفتح جسم الحيوان من أعلى المنطقة الصدرية وصولاً إلى أسفل البطن.

بعد إزالة جميع الأحشاء بعناية من التجويف البطني، ضع الجسم في طبق بتري بقطر 90 مليمتر يحتوي على وسط RF 10. ضع الطبق في غطاء استنبات أنسجة معقم، ثم انقل الجسم إلى طبق بتري معقم جديد بقطر 90 مليمتر يحتوي على وسط RF 10 طازج. بعد ذلك، قم بفصل البريتون بعناية عن الجلد في المنطقة الإربية، وحدد موقع العقد اللمفاوية الإربية الواقعة عند تقاطع ثلاثة أوعية دموية في الوسادة الدهنية.

قم بإزالة العقد اللمفاوية بعناية، مع التأكد من إزالة جميع الأنسجة الدهنية. ثم ضع العقد اللمفاوية في طبق بتري بقطر 50 مليمتر يحتوي على وسط RF 10 على الثلج لعزل الوسائد الدهنية الإربية من أجنة في اليوم 18.5. بعد إزالة الأحشاء كما تم توضيحه للتو، اغسل الأجسام في محلول PBS معقم للقضاء على جميع آثار الدم.

انقل الأجسام التي تم تنظيفها إلى طبق بتري جديد بقطر 90 مليمتر، ثم افصل الصفاق، وحدد موقع العقدة الليمفاوية الإربية وقم بإزالتها كما تم توضيحه للتو. تخلص من النسيج المعزول. احرص على إزالة العقدة الليمفاوية بالكامل لتجنب تلوث كيميرا الوسادة الدهنية.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسادة الدهنية الأربية ووضعها في طبق بتري بحجم 50 millimeter يحتوي على وسط RF 10 على الثلج. ولإعداد نظام زراعة الأعضاء في المختبر، قم أولاً بقص بعض لفافات Vulcan إلى قطع يتراوح حجمها من 1 إلى 1.5 square centimeter. ثم اغلي الإسفنج لمدة ساعتين والمرشحات لمدة 20 دقيقة في ماء مقطر، واتركها لتجف لعدة ساعات داخل غطاء زراعة الخلايا.

بمجرد جفاف المواد، ضع إسفنجة واحدة في كل طبق بتري بقطر 50 millimeter يحتوي على 2 milliliters من الوسط الغذائي. اغمر كل إسفنجة في الوسط لترطيب كلا الجانبين، ثم ضع مرشحاً واحداً في كل نظام زراعة أعضاء in vitro عند الواجهة السائلة الهوائية. بعد ذلك، أعد ربط وسادة دهنية جنينية واحدة مع عقدة لمفاوية واحدة لحديث الولادة بعناية مباشرة فوق كل مرشح.

انقل أطباق بيتري إلى صندوق بلاستيكي مستطيل يحتوي على ماء في القاع وفتحات في الغطاء. قم بتثبيت الغطاء على الصندوق باستخدام شريط لاصق مع ترك الفتحات مفتوحة. ثم ضع الصندوق في حاضنة زراعة خلايا عند 37 degree Celsius و 5%CO2.

اترك الصندوق ليتوازن لمدة ساعتين، ثم قم بسد الثقوب الموجودة في الغطاء باستخدام الشريط اللاصق. قم بحضن الأنسجة لمدة يومين على الأقل للسماح للعقد اللمفاوية بالالتصاق بالوسائد الدهنية قبل نقلها تحت كبسولة الكلية، وذلك بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من الزرع. اعزل كل خيمرة من الوسادة الدهنية للعقدة اللمفاوية داخل كل كلية وقم بتشريح العقد اللمفاوية واستخراجها.

بعد ذلك، استخدم مقصاً صغيراً لإجراء شق واحد في نسيج كل عقدة لمفاوية للمساعدة في الهضم الإنزيمي. تالياً، ضع كل عقدة لمفاوية في أنبوب إبيندورف سعة 1.5 milliliter يحتوي على 600 microliters من محلول الهضم المنظم. حضن الأنابيب لمدة 30 minutes عند 37 degrees Celsius على وحدة تسخين مهتزة، مع السحب والدفع بالماصة كل 10 minutes للمساعدة في تفكيك النسيج.

بعد ذلك، أضف 6 µL من EDTA إلى الأنابيب وقم بتجنيس معلق الخلايا بالماصة عدة مرات لإتمام عملية الفصل. يمكن بعد ذلك صبغ الخلايا بالأجسام المضادة المطلوبة وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي للحفاظ على تعبير البروتين الفلوري الأصفر المحسن أو EYFP. قم بتثبيت العقد اللمفاوية لمدة تتراوح من ثلاث إلى أربع ساعات.

بعد ذلك، لكل عقدة لمفاوية، ضع قطرة واحدة من مركب OCT البارد على قطعة صغيرة من رقائق الألومنيوم. مع تجنب تكون فقاعات الهواء، ضع بعناية عقدة لمفاوية واحدة في منتصف كل قطرة، ثم ضع الرقائق على الثلج الجاف لتجميد الأنسجة. يمكن بعد ذلك تقطيع العقد اللمفاوية، وتصبيغها، وتحليلها باستخدام المجهر الفلوري.

يسمح العزل الدقيق للعقدة اللمفاوية بإجراء مزيد من التحليل لسلالات الخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية والموجبة لـ EYFP. ويكشف تحليل المقاطع بالتجميد والتحليل المناعي الفلوري للعقدة اللمفاوية أن الخلايا المشتقة من الأنسجة الدهنية والموجبة لـ EYFP تهاجر إلى العقدة اللمفاوية حيث تساهم في شبكة الخلايا السدوية للعقدة اللمفاوية الموجبة لـ GP 38 والموجبة لـ ERTR7. ويؤكد تحليل قياس التدفق الخلوي أن جزءاً هاماً من الخلايا السدوية للعقدة اللمفاوية يشتق من الخلايا السلفية للأنسجة الدهنية المحلية والموجبة لـ EYFP، حيث تساهم بنسبة 30% من الجزء الليفي السالب لـ CD 45 والموجب لـ GP 38 والسالب لـ CD 31، وبنسبة 10% من جزء الخلايا البطانية الدموية السالب لـ CD 45 والسالب لـ GP 38 والموجب لـ CD 31. ويمكن أن يشتق ما يصل إلى 80% من الجزء الليفي السالب لـ CD 45 والموجب لـ GP 38 والسالب لـ CD 31 من الخلايا السليفة للأنسجة الدهنية، مما يبرهن على الدور الحاسم الذي تلعبه الأنسجة الدهنية في دعم نمو سدوى العقدة اللمفاوية. لذا، وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن للباحث في مجال تخلق الأعضاء اللمفاوية استكشاف دور الجزيئات المختلفة المشاركة في تكوين السدوى اللمفاوية.