ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة ألياف نانوية قائمة بذاتها، وبنيات نانوية، ومصفوفات ثنائية الأبعاد من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية المفردة أو المتعددة باستخدام التجميع المستحث سطحيًا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير قوالب بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان أو PDMS من خلال صب البوليمر الأولي PDMS على قالب رئيسي ذي نمط تضاريسي وتركه ليتصلب. وتتمثل الخطوة الثانية في قطع قوالب PDMS المتصلبة وطلاؤها بمحلول يحتوي على بروتينات المصفوفة خارج الخلوية المطلوبة.

بعد ذلك، يتم غسل الأختام وتجفيفها ثم طباعتها بتقنية الطباعة المجهرية بالتلامس على شريحة زجاجية مغطاة بـ poly N iso propyl acrylamide، أو pipe PAM. تتمثل الخطوة الأخيرة في ترطيب الشريحة الزجاجية بماء منزوع الأيونات دافئ عند 40 degrees Celsius، وتركها لتبرد تدريجياً عند خفض درجة حرارة المحلول. ويؤدي انخفاض درجة الحرارة إلى ما دون 32 degrees Celsius تقريباً إلى تحفيز ذوبان طبقة pipe PAM الحساسة حرارياً وإطلاق الألياف النانوية أو البنى النانوية البروتينية المجمعة.

في نهاية المطاف، تكون الألياف النانوية والبنى النانوية المجمعة قائمة بذاتها في المحلول، كما تم تأكيده بواسطة مجهر تباين الطور و/أو المجهر الفلوري، ويمكن استخدامها في تطبيقات إضافية مثل سقالات هندسة الأنسجة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الفصل الوجهي أو الغزل الكهربائي، في القدرة على هندسة ألياف نانوية من بروتين المصفوفة خارج الخلية (ECM) باستخدام تقنية تحاكي بدقة الطريقة التي تبني بها الخلايا عادةً ألياف المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي. وتتمتع تقنية التجميع initiated بالسطح بعدد من المزايا الفريدة، بما في ذلك القدرة على التحكم في تركيب البروتين، ومورفولوجيا الألياف، وبنية السقالة.

علاوة على ذلك، يمكننا هندسة ألياف نانوية من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية، مثل الفيبرونيكتين واللامينين والكولاجين من النوع الرابع، وهو أمر ثبتت صعوبته باستخدام أنواع أخرى من الطرق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال هندسة الأنسجة من خلال تمكين الباحثين من تطوير بنيات ذات إشارات فيزيائية وكيميائية محددة ودقيقة لتوجيه مجموعة متنوعة من سلوكيات الخلايا مثل الالتصاق والتمايز. إذا كنت مبتدئاً في هذه التقنية، يجب عليك تذكر الفحص المستمر لجودة السيقان المتاحة بالإضافة إلى دقة أنماط الطباعة الميكروية بالتلامس.

هذا أمر أساسي لضمان التجميع الصحيح للألياف النانوية والبنى النانوية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير البوليمر الأولي من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان أو PDMS عن طريق دمج القاعدة المرنة وعامل المعالجة بنسبة وزنية 10 إلى 1؛ وعادةً ما يتم استخدام 80 جراماً من القاعدة وثمانية جرامات من عامل المعالجة لضمان وجود كمية كافية من PDMS لتغطية القالب الرئيسي بطبقة سمكها 1 سنتيمتر. اخلط وأزل الغازات من PDMS باستخدام خلاط طرد مركزي مضبوط على الإعدادات التالية: خلط بسرعة 2000 RPM لمدة دقيقتين، ثم إزالة الغازات بسرعة 2000 RPM لمدة دقيقتين. ثم صب المزيج.

يُوضع البوليمر المسبق لـ PDMS فوق القالب الرئيسي لتشكيل طبقة بسمك سنتيمتر واحد هنا، ثم يتم خبز PDMS عند درجة حرارة 65 °C لمدة أربع ساعات. وبمجردما يتصلب، استخدم مشرطًا لقص المنطقة التي تحتوي على النمط لتشكيل ختم PDMS. وذلك للتمييز بين الجانب الذي يحتوي على الميزات والجانب الخلفي لختم PDMS.

قم بقص ثلمة من إحدى الزوايا في الجانب الخلفي للطابع. ابدأ هذا الإجراء بتنظيف شرائح الغطاء الزجاجية ذات القطر 25 مليمتر، وذلك بمعالجة الشرائح بالموجات فوق الصوتية في 95% ethanol لمدة ساعة واحدة، ثم تجفيفها في فرن عند 65 degrees celsius. بعد ذلك، قم بتحضير محلول poly and isopropyl acrylamide أو piam عن طريق إذابة piam في one butanol بتركيز 10%. ضع شريحة غطاء زجاجية نظيفة في مركز قاعدة التثبيت بالتفريغ (vacuum chuck) لجهاز الطلاء الدوراني (spin coer)، ثم اسحب بواسطة الماصة 200 microliters من محلول pipe Pam وضعها على السطح الزجاجي لتغطية السطح بالكامل.

قم بطلاء غطاء الشريحة بطريقة الطلاء الدوراني بسرعة 6,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. نظف أختام PDMS عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية في إيثانول بتركيز 50% لمدة 30 دقيقة، ثم جففها تحت تيار من النيتروجين؛ ويجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على التعقيم في التطبيقات التي ستُستخدم فيها البنى النانوية للمصفوفة خارج الخلوية أو ECM مع الخلايا. وتعد خطوة الطباعة بالتلامس الدقيق الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء.

من المهم فحص أختام PDMS بحثاً عن أي عيوب مرئية قبل الاستخدام. كذلك، يجب عدم استخدام محلول البروتين الذي مضى على تحضيره أكثر من أسبوعين. ضع الشرائح الغطائية المطلية بـ PIAM داخل أطباق بتري مغلقة وعقمها باستخدام التعريض للأشعة فوق البنفسجية UV.

تعتبر 45 دقيقة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في كابينة السلامة البيولوجية كافية. قم بتغطية سطح النمط لكل ختم PDMS بـ 200 µL من محلول البروتين. يُستخدم الفبرونيكتين أو FN هنا بتركيز 50 µg/mL في ماء مقطر معقم.

يُحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تُغسل أختام PDMS بالماء المقطر بعد مرور ساعة لإزالة البروتين الزائد وتُجفف تماماً تحت تيار من النيتروجين. من المهم إزالة الماء بالكامل لتجنب الذوبان المبكر للأنبوب، أو تأثر طلاء Pam على غطاء الشريحة، أو حدوث نقل غير صحيح للبروتين.

قم بإجراء الطباعة بالتلامس الدقيق عن طريق وضع الجانب الذي يحتوي على الميزات من ختم PDMS في تلامس مع غطاء الشريحة المطلي بـ PAM الأنبوبي إذا لزم الأمر. استخدم الملاقط للنقر بخفة على ظهر الأختام لإزالة أي فقاعات هوائية وضمان التلامس الموحد بعد خمس دقائق. قم بنزع ختم PDMS من غطاء الشريحة.

في هذه المرحلة، وبناءً على الدراسة، يمكن تشكيل بروتينات إضافية من المصفوفة خارج الخلوية (ECM) لإنشاء هياكل أكثر تعقيداً ومتعددة المكونات. وبمجرد طباعة نمط المصفوفة خارج الخلوية، ضع شريحة التغطية المطلية بـ PAM والمنقوشة في طبق بتري بقطر 35 مليمتر، وافحص دقة النمط باستخدام مجهر تباين الطور.

اعتماداً على نمط التشكيل، قد يكون من الضروري استخدام كاميرا CCD لتمييز ملامح النمط. كما يمكن استخدام المجهر الفلوري لفحص النمط، شريطة أن تكون بروتينات ECM موسومة فلورياً. بعد التحقق من دقة النمط، أضف ثلاثة مليلترات من الماء المقطر بدرجة حرارة 40 °C إلى طبق Petri واترك الماء ليبرد تدريجياً مما يؤدي إلى إذابة الأنبوب.

يمكن مراقبة طبقة PAM وتحرر أنماط بروتين ECM باستخدام مجهر تباين الطور. وعادةً، ولضمان تحرر البنى النانوية لبروتين ECM، يتم تبريد الماء إلى درجة حرارة الغرفة، وهي درجة أقل بكثير من درجة الحرارة الحرجة الدنيا لمحلول pipe, pam، والتي تبلغ 32 درجة مئوية. وإذا كان التطبيق لا يسمح باستخدام التقنيات البصرية، فيمكن مراقبة التحرر عن طريق قياس درجة حرارة المحلول.

ستطفو الألياف النانوية والبنى النانوية الأخرى في الماء بعد تحرير طبقة PAM في الأنبوب. ولأغراض التطبيقات اللاحقة، يجب التعامل مع الأنسجة النانوية والبنى النانوية الأخرى، إلا أن النهج الدقيق سيعتمد على الهدف التجريبي. تُعرض هنا نتائج نموذجية لإثبات أن التجميع المستحث سطحياً أو SIA قادر على هندسة الألياف النانوية لبروتينات ECM مع تحكم دقيق في أبعاد الألياف.

تم تشكيل مصفوفة من مستطيلات الفبرونكتين، بطول 50 ميكرومتر وعرض 20 ميكرومتر، على شريحة غطاء مطلية بـ piam، وبإضافة ماء منزوع الأيونات عند درجة حرارة 40 درجة مئوية يليه التبريد إلى ما دون درجة الحرارة الحرجة الدنيا للمحلول. أدى ذلك إلى تحلل piam وتحرير ألياف الفبروين النانوية عند الإطلاق. وانكمشت الألياف لأنها كانت تحت إجهاد مسبق متأصل.

عندما تم تشكيلها على سطح piam، كشف تحليل Alice لأبعاد ألياف الفبرونكتين النانوية قبل التحرير أنها كانت أحادية التشتت بمتوسط طول 50.19 ± 0.49 µm ومتوسط عرض 19.98 ± 0.17 µm. وعند التحرير، انكمشت الألياف النانوية بشكل ملحوظ ولكنها ظلت أحادية التشتت بمتوسط طول 14.15 ± 0.92 µm ومتوسط عرض 2.65 ± 0.32 µm. وقد وفر مجهر القوة الذرية منظورًا أعلى دقة للتغيرات البعدية للألياف المرتبطة بعملية تحرير SIA.

ومن الملاحظ أن الألياف قبل الإطلاق كانت ذات سمك منتظم يبلغ حوالي five nanometers، بينما كان سمك الألياف بعد الإطلاق في حدود عدة مئات من nanometers، في حين انخفض الطول والعرض. وباستخدام عملية SIA، يمكن هندسة مجموعة متنوعة من البنى النانوية لبروتينات ECM بأحجام وأشكال وتركيبات قابلة للضبط. فعلى سبيل المثال، تم تشكيل ألياف نانوية من fibronectin بعرض 20 micrometers وطول one centimeter على أنبوب.

شريحة غطاء مغلفة بـ PAM بعد التبريد والأنبوب. عند ذوبان Pam، تحررت الألياف النانوية مكونةً خيوطاً طويلة بعرض مخفض يبلغ حوالي ثلاثة ميكرومترات. علاوة على ذلك، وبما أن النمط يتم تحديده بواسطة التضاريس السطحية لختم PDMS المستخدم في الطباعة بالتلامس الدقيق، فمن الممكن هندسة هياكل نانوية معقدة من بروتين ECM كإثبات للمفهوم.

تم إنشاء نجوم فيبروين متعددة الأذرع. وأدى التحرر الحراري إلى انكماش الأذرع، ولكن ليس المنطقة المركزية للنجم حيث تلتقي الأذرع معاً. كما تعمل تقنية SIA مع بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) الأخرى مثل اللامينين أو LN، ويمكن دمج عدة بروتينات من المصفوفة خارج الخلية في الهيكل نفسه.

في هذا المثال، تم تشكيل خطوط متعامدة ومترابطة من الفيبرونيكتين بعرض 20 ميكرومتر تظهر باللون الأحمر وخطوط من اللامينين بعرض 50 ميكرومتر تظهر باللون الأخضر مدمجة في نسيج نانوي ثنائي الأبعاد، ثم تم تحريرها؛ وعند التحرير، انكمشت كلا النوعين من الألياف النانوية، ولكن تم الحفاظ على الترابط العام وهيكل الشبكة المربعة. وتوضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام تقنية SIA لهندسة مواد المصفوفة خارج الخلوية (ECM) بتكوينات وهياكل متنوعة. وأخيرًا، يتم عرض بعض حالات فشل تقنية SIA للألياف النانوية للمصفوفة خارج الخلوية.

أحد الأسباب هو التحرير غير السليم لنمط غير مكتمل نتيجة لضعف انتقال بروتين ECM إلى سطح piam. فخلال عملية الطباعة بالتلامس الدقيق، يؤدي وجود الثقوب والحواف غير المنتظمة والعيوب الأخرى إلى تكوين ألياف نانوية وبنى نانوية غير مكتملة وعرضة للكسر والتجزؤ عند التحرير. كما يمكن أن يتسبب الذوبان السريع لـ pipe PAM في ضعف دقة النمط بعد التحرير.

على سبيل المثال، عند استخدام ماء بدرجة حرارة 20 °C، وهي درجة حرارة أقل بالفعل من درجة الحرارة الحرجة الدنيا للمحلول، فإن درجة حرارة piam ستؤدي إلى انتفاخ piam وذوبانه بسرعة. يمكن أن يتسبب ذلك في ارتداد الألياف النانوية وانكسارها كما هو موضح في الصورة الثانية والثلاثين، وتشكيل تكوينات عشوائية غير منظمة كما هو موضح في الصورة الثانية والخمسين.

قبل البدء في هذا الإجراء، يجب فحص حالة سيقان PDMS للتأكد من خلوها من العيوب، والتأكد أيضاً من أن جميع الأسطح خالية من الغبار؛ وإلا فإن ذلك سيمنع الانتقال السليم للبروتين ويؤدي إلى تجميع رديء لبنى A CM. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن استخدام الألياف النانوية أو البنى النانوية المتحررة للقيام بعدة أمور، مثل تحليل الخصائص الميكانيكية للألياف البروتينية، أو استخدامها كسقالات لهندسة الأنسجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هندسة الألياف والبنى النانوية لبروتينات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) ذات التركيب والهندسة والبنية القابلة للضبط. وبشكل أكثر تحديداً، سوف تفهم كيفية استخدام الطباعة بالتلامس الدقيق لطباعة أنماط من بروتينات ECM على شرائح زجاجية مغطاة بالبايثون، ثم التحفيز الحراري لإذابة السطح من أجل تجميع بنيات ECM.