ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة ألياف النانو القائمة بذاتها ، والبنى النانوية ، والمصفوفات ثنائية الأبعاد من بروتينات مصفوفة مفردة أو متعددة خارج الخلية باستخدام التجميع الذي يبدأ السطح. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير طوابع بولي ثنائي ميثيل أو PDMS أولا عن طريق صب البوليمر المسبق PDMS على قالب رئيسي منقوش طوبوغرافيا والسماح له بالشفاء. الخطوة الثانية هي قطع طوابع PDMS المعالجة وتغطيتها بمحلول يحتوي على بروتينات المصفوفة خارج الخلية المطلوبة.

بعد ذلك ، يتم غسل الطوابع وتجفيفها وطباعة التلامس الدقيق على أكريلاميد بولي N iso بروبيل ، أو زلة غطاء زجاجي مطلي بالأنبوب PAM. الخطوة الأخيرة هي ترطيب زلة الغطاء بالماء الدافئ منزوع الأيونات 40 درجة مئوية والسماح لها بالتبريد تدريجيا لتقليل المحلول. تؤدي درجة الحرارة التي تقل عن حوالي 32 درجة مئوية إلى انحلال طبقة PAM للأنبوب الحساسة حراريا وإطلاق ألياف النانو البروتينية المجمعة أو الهياكل النانوية.

في النهاية ، فإن ألياف النانو المجمعة والهياكل النانوية قائمة بذاتها في المحلول كما هو مؤكد من خلال تباين الطور و / أو الفحص المجهري الفلوري ، ويمكن استخدامها في تطبيقات أخرى مثل سقالات هندسة الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل فصل الوجه أو الغزل الكهربائي ، هي القدرة على هندسة ألياف النانو لبروتين ECM باستخدام تقنية تحاكي حقا الطريقة التي تبني بها الخلايا عادة ألياف ECM في الجسم الحي. تتميز تقنية التجميع التي بدأت على السطح بعدد من المزايا الفريدة ، بما في ذلك القدرة على التحكم في تكوين البروتين ، ومورفولوجيا الألياف ، وهندسة السقالات.

علاوة على ذلك ، يمكننا هندسة ألياف نانو بروتين ECM من بروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل صفائح الألياف نين ، والكولاجين من النوع الرابع ، والذي ثبت أنه صعب استخدام أنواع أخرى من الطرق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة من خلال تمكين الباحثين من تطوير تركيبات ذات إشارات فيزيائية وكيميائية محددة ومحددة جيدا لتوجيه مجموعة متنوعة من سلوكيات الخلايا مثل الالتصاق والتمايز. إذا كنت جديدا على هذه التقنية ، فيجب أن تتذكر أن تفحص باستمرار جودة سيقانك بالإضافة إلى دقة الأنماط المطبوعة ذات التلامس الصغير.

هذا ضروري للحصول على التجميع المناسب لألياف النانو والهياكل النانوية ECM. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد بولي ثنائي ميثيل سوان أو البوليمر المسبق PDMS عن طريق الجمع بين قاعدة المطاط الصناعي وعامل المعالجة بنسبة وزن 10 إلى واحد لكل وزن ، وعادة ما يتم استخدام 80 جراما من القاعدة وثمانية جرامات من عامل المعالجة لضمان وجود PDMS كاف لتغطية القالب الرئيسي في مزيج طبقة بسمك سنتيمتر واحد و DGAs PDMS باستخدام خلاط جاذب الجاذبية مضبوطة على المزيج التالي في 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين ، DGAs عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. فقير بما فيه الكفاية.

PDMS قبل البوليمر فوق القالب الرئيسي لتشكيل طبقة بسمك سنتيمتر واحد هنا ، PDMS عن طريق الخبز عند 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بمجرد المعالجة ، استخدم مشرطا لقطع المنطقة التي تحتوي على النمط لتشكيل ختم PDMS. لتمييز جانب المعالم عن الجانب الخلفي لطابع PDMS.

قطع شق من إحدى الزوايا على الجانب الخلفي من الطابع. ابدأ هذا الإجراء بتنظيف زلات الغطاء الزجاجي بقطر 25 ملم ، وصوتنة زلات الغطاء في 95٪ من الإيثانول لمدة ساعة واحدة ، ثم تجفيفها في فرن 65 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول بولي وأيزوبروبيل أكريلاميد أو بيام لإذابة البيام في بوتانول واحد بتركيز 10٪ مركز غطاء زجاجي نظيف على ظرف الفراغ لجهاز الدوران والماصة 200 ميكرولتر من محلول الأنبوب بام على السطح الزجاجي لتغطية السطح بالكامل.

قم بتدوير زلة الغطاء عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. قم بتنظيف طوابع PDMS عن طريق صوتنة في 50٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ، ثم التجفيف تحت تيار من تجفيف النيتروجين ويجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة الحيوية للحفاظ على العقم للتطبيقات التي سيتم فيها استخدام المصفوفة خارج الخلية أو هياكل النانو ECM مع الخلايا. خطوة طباعة الاتصال الصغير هي أصعب جانب في هذا الإجراء.

من المهم فحص طوابع PDMS بحثا عن أي عيوب مرئية قبل الاستخدام. أيضا ، لا تستخدم محلول البروتين الذي يزيد عمره عن أسبوعين. ينزلق الغطاء المطلي ب PIAM داخل طبق بتري مغلق ويعقم باستخدام التعرض للأشعة فوق البنفسجية.

45 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة الحيوية كافية. قم بتغطية سطح النمط لكل ختم PDMS ب 200 ميكرولتر من محلول البروتين. يستخدم الفبرونيكتين أو FN هنا بتركيز 50 ميكروغرام لكل مليلتر في الماء المقطر المعقم.

احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة واحدة ، اغسل طوابع PDMS والماء المقطر لإزالة البروتين الزائد وجففها جيدا تحت تيار من النيتروجين. من المهم إزالة الماء تماما لتجنب الذوبان المبكر للأنبوب. طلاء بام على زلة الغطاء ونقل البروتين بشكل غير صحيح.

قم بإجراء طباعة التلامس الصغير عن طريق وضع جانب الميزة لختم PDMS على اتصال مع زلة غطاء الأنبوب المطلي ب PAM إذا لزم الأمر. استخدم الملقط للنقر برفق على الجزء الخلفي من الطوابع لإزالة أي فقاعات هواء وضمان ملامسة موحدة بعد خمس دقائق. انزع ختم PDMS من زلة الغطاء.

في هذه المرحلة. اعتمادا على الدراسة ، يمكن تصميم بروتينات ECM إضافية لإنشاء هياكل أكثر تعقيدا ومتعددة المكونات. بمجرد طباعة نمط ECM ، ضع زلة غطاء الغطاء المطلية بالأنبوب المزخرف PAM في طبق بتري مقاس 35 ملم وافحص دقة النمط باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.

اعتمادا على النمط ، قد تكون كاميرا CCD ضرورية لحل ميزات النمط. يمكن أيضا استخدام الفحص المجهري الفلوري لفحص النمط بشرط أن يتم تمييز بروتينات ECM بالفلورسنت. بعد التحقق من دقة النمط ، أضف ثلاثة ملليلتر من الماء المقطر 40 درجة مئوية إلى طبق بتري واترك الماء يبرد تدريجيا ، وذوبان الأنبوب.

يمكن مراقبة طبقة PAM وإطلاق أنماط بروتين ECM باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. عادة لضمان إطلاق الهياكل النانوية لبروتين ECM ، يتم تبريد الماء إلى درجة حرارة الغرفة أقل بكثير من درجة حرارة المحلول الحرجة المنخفضة للأنبوب ، بام ، والتي تبلغ 32 درجة مئوية. إذا كان التطبيق لا يسمح باستخدام التقنيات البصرية ، فيمكن مراقبة الإطلاق عن طريق قياس درجة حرارة المحلول.

سوف تطفو ألياف النانو والهياكل النانوية الأخرى في الماء بعد إطلاق طبقة PAM الأنبوبية. لمزيد من التطبيقات ، يجب التلاعب بالأقمشة النانوية والهياكل النانوية الأخرى ، لكن النهج الدقيق سيعتمد على الهدف التجريبي. يتم تقديم النتائج التمثيلية هنا لإثبات أن التجميع السطحي أو SIA قادر على هندسة ألياف النانو لبروتين ECM مع التحكم الدقيق في أبعاد الألياف.

تم تصميم مجموعة من مستطيلات الفيبرونيكتين ، بطول 50 ميكرومتر وعرضها 20 ميكرومتر على غطاء مغلف بيام ، إضافة انزلاق 40 درجة مئوية من الماء DI والتبريد اللاحق أسفل المحلول الحرج السفلي. أدت درجة حرارة البيام إلى انحلال البيام وإطلاق ألياف النانو الليفية عند إطلاقها. تقلصت الألياف لأنها كانت تحت إجهاد متأصل.

عند تصميمها على سطح البيام ، كشف تحليل أليس لأبعاد الألياف النانوية الفيبرونيكتين قبل الإطلاق أنها كانت أحادية التشتت بمتوسط طول 50.19 زائد أو ناقص 0.49 ميكرومتر ومتوسط عرض 19.98 زائد أو ناقص 0.17 ميكرومتر. عند الإطلاق ، تقلصت ألياف النانو بشكل ملحوظ ولكنها ظلت أحادية التشتت بمتوسط طول 14.15 زائد أو ناقص 0.92 ميكرومتر ومتوسط عرض 2.65 زائد أو ناقص 0.32 ميكرومتر. قدم الفحص المجهري للقوة الذرية منظورا أعلى دقة لتغيرات أبعاد الألياف المرتبطة بعملية إطلاق SIA.

والجدير بالذكر أن ألياف ما قبل الإطلاق كان لها سمك موحد يبلغ حوالي خمسة نانومتر ، في حين أن ألياف ما بعد الإطلاق كان لها سمك يبلغ عدة مئات من النانومتر بينما انخفض الطول والعرض. باستخدام عملية SIA ، من الممكن هندسة مجموعة متنوعة من الهياكل النانوية لبروتين ECM بحجم وشكل وتكوين قابل للضبط. على سبيل المثال ، تم تصميم ألياف النانو الفيبرونيكتين التي يبلغ عرضها في البداية 20 ميكرومترا وطولها سنتيمترا واحدا على أنبوب.

زلة غطاء المغلفة PAM عند التبريد والأنابيب. انحلال بام ، تم إطلاق ألياف النانو لتشكيل خيوط طويلة بعرض منخفض يبلغ حوالي ثلاثة ميكرومترات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن النمط يتم تحديده من خلال التضاريس السطحية لختم PDMS المستخدم في طباعة التلامس الدقيق ، فمن الممكن هندسة الهياكل النانوية المعقدة لبروتين ECM كدليل على المفهوم.

تم إنشاء نجوم فيبروين متعددة الأذرع. أدى الإطلاق الحراري إلى تقلص الذراعين ، ولكن ليس المنطقة الوسطى من النجم حيث انضمت الذراعين معا. يعمل SIA أيضا مع بروتينات ECM الأخرى مثل الصفائح أو LN ، ويمكن دمج بروتينات ECM المتعددة في نفس الهيكل.

في هذا المثال ، تم تصميم خطوط متعامدة مترابطة بعرض 20 ميكرومتر من الفيبرونيكتين الموضحة باللون الأحمر وخطوط اللامينين بعرض 50 ميكرومتر الموضحة باللون الأخضر المدمجة في نسيج نانو ثنائي الأبعاد ثم تم إطلاقها عند إطلاقها ، ولكن تم الحفاظ على الترابط الكلي وهيكل الشبكة المربعة. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام SIA لهندسة مواد ECM مع مجموعة متنوعة من التراكيب والهياكل. أخيرا ، يتم عرض بعض حالات SIA الفاشلة لألياف النانو ECM.

أحد الأسباب هو الإطلاق غير السليم لنمط غير مكتمل بسبب سوء نقل بروتين ECM إلى سطح البيام. أثناء طباعة التلامس الجزئي ، سيؤدي وجود ثقوب وحواف غير منتظمة وعيوب أخرى إلى إنشاء ألياف نانوية وهياكل نانوية غير مكتملة وعرضة للكسر والتجزئة عند إطلاقها. يمكن أن يتسبب الذوبان السريع للأنبوب PAM أيضا في ضعف دقة النمط بعد الإفراج.

على سبيل المثال ، باستخدام 20 درجة مئوية من الماء ، وهي درجة حرارة أقل بالفعل من المحلول الحرج السفلي. ستؤدي درجة حرارة البيام إلى انتفاخ البيام وذوبان بسرعة. يمكن أن يتسبب ذلك في عودة ألياف النانو وانكسار كما هو موضح في الصورة 32 وتشكيل تكوينات عشوائية غير منظمة كما هو موضح في الصورة التي تبلغ مدتها 52 ثانية.

قبل البدء في هذا الإجراء ، تنبع حالة PDMS من العيوب وتأكد أيضا من خلو جميع الأسطح من الغبار. خلاف ذلك ، سيمنع نقل البروتين بشكل صحيح ويؤدي إلى سوء تجميع هياكل A CM. لذلك باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام ألياف النانو أو الهياكل النانوية المطلقة للقيام بعدد من الأشياء مثل تحليل الخواص الميكانيكية لألياف البروتين ، أو استخدامها كسقالات لهندسة الأنسجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هندسة ألياف النانو والبنية النانوية لبروتين ECM مع تكوين وهندسة وهندسة قابلة للضبط. على وجه التحديد ، يجب أن تفهم كيفية الاتصال الدقيق بأنماط الطباعة لبروتينات ECM على زلات الغطاء الزجاجي المطلي بالثعبان ، ثم يؤدي حراريا إلى إذابة السطح لتجميع هياكل ECM.