إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة المكورات العنقودية البشروية و المتفطرة البحرية عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات
يونيو 26, 2014
توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان.
الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد أعداد كبيرة من أجنة أسماك الحمار الوحشي المصابة لاختبار مركب عالي الإنتاجية لتمكين اكتشاف الأدوية. يتم تحقيق ذلك أولا باستخدام وعاء تكاثر كبير للحصول على أعداد كبيرة من بيض سمك الزرد المتزامن في حدث واحد. بعد ذلك ، يتم محاذاة البيض في شبكة aros ويصاب بالبكتيريا الموجودة في صفار البيض باستخدام حاقن دقيق آلي.
عندما تنتشر العدوى عبر الأجنة ، يتم علاجها عن طريق قياس تدفق الجسيمات الكبيرة قبل علاجها بالأدوية. أخيرا ، يتم تحليل مستويات العبء البكتيري في الأجنة المصابة بعد العلاج المركب. في النهاية ، تحليل عالي الدقة من خلال فقرة مجهرية متحدة البؤر.
يتم استخدام الفحص الآلي وأخذ عينات الجسيمات الكبيرة لإظهار تأثيرات المركبات على العدوى بمزيد من التفصيل. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على التقنيات الحالية مثل الحقن اليدوي أو تحليل مسح PIX ، هي أنه يمكننا من خلالها توليد كمية كبيرة من الأجنة المصابة بشكل متجانس ، والتي يمكننا تحليلها بطريقة عالية الإنتاجية. لتحضير لقاح البشرة S ، قم بعزل العديد من المستعمرات الفردية من صفيحة من سلالة البشرة S ، O 47 التي تحتوي على ناقل تعبير الكرز PW VW 180 9 المشتق ، وتلقيحه.
25 مل من LB مكمل مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. يحتضن الكلورامفينيكول بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية إلى مرحلة منتصف القفل في اليوم التالي ، والطرد المركزي ملليلتر واحد من الثقافة عند 12 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة واستخدم ملليلتر واحد من PBS المعقم مع 0.3٪ حجم لكل حجم بين 80 لغسل الحبيبات ثلاث مرات. قم بقياس الكثافة البصرية عند OD 600 واستخدم 2٪ الوزن لكل حجم ، أو البولي فينيل بيرون 40 أو PVP 40 في PBS لتخفيف التعليق البكتيري إلى OD 600 يساوي 0.3 أو مرة واحدة في 10 إلى ثمانية CFUs لكل مليلتر.
لتحضير لقاح أمينوم ، قم بعزل عدة مستعمرات فردية من سلالة M Meum ، M أو E 11 ، معبرا بثبات عن ناقل الكرز PS MT 3M من Middlebrook seven H 10 تهوية وتلقيح 10 مل من مرق Middlebrook seven H تسعة يحتوي على 10٪ حجم لكل حجم. يحتضن تخصيب Middlebrook A DC المكمل ب 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من hygromycin بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية في اليوم التالي. جهاز طرد مركزي واحد مليلتر من الثقافة عند 12 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة واستخدم ملليلتر واحد من PBS المعقم مع 0.3٪ حجم لكل حجم بين 80 لغسل الحبيبات ثلاث مرات.
قم بقياس OD 600 من التعليق البكتيري وبوزن 2٪ لكل حجم. PVP 40 في PBS مخفف إلى OD 600 من 0.3 أو 0.3 في 10 إلى ثمانية CFUs لكل مليلتر للحصول على بيض أسماك الحمار الوحشي في الليلة السابقة للتجميع ، ضع 50 أنثى من سمكة الحمار الوحشي كحد أقصى في الغرفة السفلية لوعاء تربية كبير و 70 ذكرا في الجزء العلوي من السفينة. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة الفاصل من الوعاء بعد حوالي ساعة واحدة من خلال مجمع البيض في قاع وعاء التكاثر ، اجمع البيض في أنبوب سعة 50 مليلتر مملوء بماء البيض.
بعد تحضير لوحات الحقن ، وفقا لبروتوكول النص الموجود على برنامج تشغيل الحاقن الصغير الآلي ، انقر فوق مرحلة المعايرة ، ثم انقر فوق 10 24. شبكة جيدة وضع لوحة aros في الحاقن الصغير ، ومعايرة اللوحة بالنقر فوق الشاشة في الموضع المركزي للبئر. ثم انتقل إلى قائمة الإبرة وانقر على معايرة حامل الإبرة.
باستخدام طرف اللودر الصغير ، املأ إبرة حقن بقطر 10 ميكرون إما ب 10 ميكرولتر من PVP 40 تحتوي على 100 CFUs لكل نانولتر من بشرة S ، أو 30 CFUs لكل نانولتر من الإيروم أو PVP 40 وحده للحقن الوهمي ، ضع الإبرة في الحاقن الآلي الصغير وقم بمعايرة موضع XY عن طريق خفض أو تحريك الإبرة لأعلى والنقر على الشاشة في موضع الإبرة. ثم قم بمعايرة الموضع Z للإبرة بالنقر على الشاشة في موضع طرف الإبرة. بعد ذلك ، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لتوزيع البيض على شبكة aros وإزالة أي ماء بيض زائد.
ثم ضع شبكة agros المملوءة بالبيض في الحاقن الآلي الصغير في قائمة الحقن ، واضبط إعداد ضغط الحقن على 200 هكتار باسكال ، ووقت الحقن إلى 0.2 ثانية ، وضغط التعويض إلى 15 هيكتور باسكال ، والذي يرتبط بنانولتر واحد في قائمة إعدادات Femto jet. انقر فوق حقن الكل وحقن صفيحة الأجنة بأكملها بعد الحقن. اجمع البيض عن طريق غسله في طبق بتري واحتضانه على حرارة 28 درجة مئوية.
بمجرد إعداد مقياس تدفق الجسيمات الكبيرة ، ادخل إلى قائمة PMT واضبط القناة الحمراء على 650 فولت والقنوات الخضراء والصفراء على صفر فولت. ثم ضمن قائمة العتبات ، اضبط إشارة عتبة الكثافة الضوئية على 50 ، المقابلة مع 975 مللي فولت والحد الأدنى لوقت الرحلة إلى 800 ، المقابل ل 320 ميكروثانية. من أجل تقليل تأثير الحطام ، ضع الأجنة في كوب العينة وفي قائمة الفرز للعثور على الحد الأقصى البالغ 70 جنينا لكل صفيحة ليتم فرزها عن طريق إدخال 70.
ضع طبق بتري فارغ أسفل الفرز وانقر على الفرز اليدوي. عند ملء طبق بتري ، احفظ البيانات بالنقر فوق المتجر. إذا كان التحليل أو التصوير عالي الدقة مطلوبا ، فيمكن فرز الأجنة بشكل فردي في آبار من صفيحة 96 بئر.
ضع الأجنة في كوب العينة وحدد الحد الأقصى لجنين واحد لكل بئر ليتم فرزه. ثم ضع لوحة 96 بئر فارغة في حامل اللوحة الأيسر وانقر على لوحة التعبئة. عندما تمتلئ اللوحة ، احفظ البيانات بالنقر فوق المتجر لتحليل الأجنة المعالجة بالمخدرات بعد ثلاثة أيام من الحقن مع الإيروم.
عالج مجموعة واحدة من الأجنة بمركب ذي أهمية في المذيبات ومجموعة ثانية بالمذيب وحده. ضع الأجنة المعالجة بعد أربعة وخمسة أيام من الإخصاب في كوب العينة على مقياس التدفق الخلوي واضبط الفرز على 70 جنينا لكل طبق بعد تخدير الأجنة في trica ، وإعداد نظام الفحص الآلي للفقاريات وأخذ عينات الجسيمات الكبيرة. وفقا لبروتوكول النص من قائمة إعداد اكتشاف كائن التصوير ، حدد الصور المرجعية المقابلة لعمر الأجنة في قائمة الصور التخزينية التلقائية للتصوير ، وحدد عدد الصور المراد إنشاؤها والاتجاه المراد استخدامه.
ضع صفيحة بئر 96 مملوءة بالأجنة في حامل اللوحة الأيسر لجهاز أخذ عينات الجسيمات الكبيرة وانقر على لوحة التشغيل. عندما يتم وضع الجنين بشكل صحيح ، استخدم هدفا جافا عاديا 10 × وصور الرأس والذيل بشكل منفصل. ثم استخدم برنامج معالجة الصور لتجميع الصور معا لتقييم المرحلة التنموية الأفضل لعدوى صفار البيض.
تم إجراء الحقن بالتهاب الجلد والماروم في جميع المراحل المختلفة بين مرحلة الخلية الواحدة و 512. كما هو موضح هنا ، قدمت الحقن مع 100 CFU من التهاب الجلد التي يتم إجراؤها بين مرحلة الخلية 16 و 128 أفضل نمط للعدوى. انتشرت البكتيريا داخل صفار البيض لمدة ثلاثة أيام وانتشرت في الجسم من ثلاثة أيام بعد الإصابة فصاعدا.
تم إجراء القياس الكمي عالي الإنتاجية للعبء البكتيري عن طريق تحليل شدة التألق باستخدام مقياس تدفق الجسيمات الكبير. كما هو موضح هنا ، فإن كمية البكتيريا الحية الموجودة داخل الجنين تتوافق جيدا مع إشارة الفلورسنت المقاسة. يوضح هذا الشكل أن المرحلة التنموية المثلى لحقن 30 CFUs من أمينوم هي بين 16 و 128 مرحلة الخلية لسلالة E 11 وبين مرحلة 16 و 64 خلية.
مع سلالة EM الأكثر ضراوة ، أظهرت الأجنة التي تم حقنها في هذه المراحل نموا بكتيريا داخل البلوط وانتشار البكتيريا عبر الجنين. بعد العلاج المتكرر للأجنة المصابة بالإيميرين بتركيزات مختلفة من ريفامبيسين أظهر انخفاضا في العدوى الفطرية بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهر استخدام الدواء بجرعة 200 ميكرومولار أنه أوقف بشكل فعال تطور البكتيريا ل M mein E 11 ، 24 ساعة وما بعده بعد العلاج بعد تطوره.
مهدت هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال الاختبارات المركبة وتطوير الأدوية ، والبحث عن علاجات جديدة للأمراض المعدية مثل السل أو الالتهابات المرتبطة بالمواد الحيوية.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة المرئية pipeline عالي الإنتاجية تم إنشاؤه لإصابة وتحليل عدد كبير من أجنة أسماك الزرد، مما يوفر أداة قوية لاختبار المركبات واكتشاف الأدوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- اكتشاف الأدوية
- بيولوجيا العدوى
الخلفية
- يتم استخدام أجنة أسماك الزرد ككائن نموذجي لدراسة العدوى.
- تتيح الطرق عالية الإنتاجية تحليل أحجام كبيرة من العينات.
- تحسن التقنيات الآلية الكفاءة والاتساق في التجارب.
- يمكن أن يكشف اختبار الأدوية على الأجنة المصابة عن فعالية المركبات.
غرض الدراسة
- لتوليد أعداد كبيرة من أجنة أسماك الزرد المصابة للاختبار.
- لتحليل تأثيرات المركبات على الالتهابات البكتيرية.
- لتعزيز عمليات اكتشاف الأدوية باستخدام نموذج الفقاريات.
الطرق المستخدمة
- استخدام وعاء تربية كبير لجمع البيض بشكل متزامن.
- حقن ميكروي آلي للبكتيريا في صفار الزرد.
- قياس التدفق الخلوي للجسيمات الكبيرة لفرز الأجنة.
- الميكروسكوب المتحد البؤر لتحليل عالي الدقة للالتهابات.
النتائج الرئيسية
- تسمح الإصابة الناجحة للأجنة بتحليل عالي الإنتاجية.
- تنتج الطرق الآلية أجنة متأثرة بشكل متجانس.
- يمكن تقييم تأثيرات العلاج الدوائي بشكل كمي.
- يكشف التصوير عالي الدقة عن تفاعلات مفصلة بين المركبات والالتهابات.
الاستنتاجات
- يعزز الـ pipeline المنشأ بشكل كبير من جهود اكتشاف الأدوية.
- توفر التقنيات الآلية نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لمختلف سيناريوهات اختبار المركبات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This high throughput zebrafish infection model bridges the gap between cell-based assays and mammalian in vivo validation, enabling early-stage compound screening with whole-animal physiological relevance. By generating large numbers of synchronously infected embryos, the method supports predictive confidence in target validation and reduces late-stage attrition in anti-infective drug discovery pipelines. The scalable workflow accommodates diverse bacterial pathogens and compound libraries, enhancing translational continuity from hit identification to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-animal infection context, clarifying pathogen-host interactions and target essentiality.
- Operational Value: Supports biological de-risking through homogeneous, synchronized infection models that reduce variability in phenotypic screening outcomes.
- Predictive Value: Facilitates early go/no-go decisions by quantifying compound effects on bacterial burden in vivo, improving portfolio triage efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems amenable to downstream compound evaluation.
- Operational Value: Employs automated microinjection and large particle flow cytometry to ensure assay consistency, scalability, and high sample throughput.
- Screening Readiness: Generates quantitative fluorescence-based readouts of bacterial burden, enabling reliable dose-response analysis and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by modeling Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infections, which reflect biomaterial-associated and tuberculosis-related pathologies.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking early efficacy signals to known antimicrobial mechanisms, such as rifampicin dose-dependent inhibition.
- Mechanistic De-risking: Enables use of transgenic zebrafish lines to decipher compound mode of action, strengthening target confidence before mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for anti-infective programs requiring whole-animal validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time monitoring of infection dynamics and compound interference in a vertebrate host.
- Screening: Delivers assay readiness through automated embryo alignment, precise yolk injection, and presorting via flow cytometry to ensure uniform starting conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity analysis, allowing objective comparison of bacterial burden across treatment groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through dose-response profiling of known antibiotics, establishing predictive biomarkers of efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse compound libraries against multiple pathogens, reducing reliance on bespoke assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of infection modulation in vivo.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated workflows and synchronized embryo production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in anti-infective programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative in vivo efficacy data from high throughput screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection techniques, and flow cytometry operation.
- Dependent on automated microinjectors, large particle flow cytometers, and fluorescence detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols, compound preparation, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, transgenic lines, and infection readouts based on pathogen virulence and host response.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-infection and the need for optimization of bacterial inoculum titers for consistent phenotype penetration.
