إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج أعداد كبيرة من أجنة سمك الزيبرا المصابة لإجراء اختبارات المركبات عالية الإنتاجية لتمكين اكتشاف الأدوية. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخدام وعاء تزويج كبير أولاً للحصول على أعداد كبيرة من بيوض سمك الزيبرا المتزامنة في حدث واحد. بعد ذلك، يتم ترتيب البيوض في شبكة aros وإصابتها بالبكتيريا في المح، باستخدام محقن دقيق آلي.

عندما تنتشر العدوى عبر الأجنة، يتم فرزها مسبقاً باستخدام قياس التدفق الخلوي للجسيمات الكبيرة قبل معالجتها بالأدوية. وفي النهاية، يتم تحليل مستويات العبء البكتيري في الأجنة المصابة بعد المعالجة بالمركبات. وفي الختام، يتم إجراء تحليل عالي الدقة من خلال المجهر البؤري للفقرات.

يُستخدم الفحص الآلي وأخذ عينات من الجسيمات الكبيرة لإظهار تأثيرات المركبات على العدوى بمزيد من التفصيل. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الحالية، مثل الحقن اليدوي أو تحليل مسح PIX، في قدرتنا من خلالها على إنتاج كمية كبيرة من الأجنة المتأثرة بشكل متجانس، والتي يمكننا تحليلها بطريقة عالية الإنتاجية. لتحضير لقاح S epiderm، يتم عزل عدة مستعمرات فردية من طبق يحتوي على سلالة S epiderm، O 47 التي تحتوي على ناقل تعبير M cherry مشتق من A PW VW 180 9، ثم يتم التلقيح.

يتم تحضين 25 milliliters من وسط LB المضاف إليه 10 micrograms per milliliter من Chloramphenicol طوال الليل عند 37 °C حتى الوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط؛ وفي اليوم التالي، يتم طرد 1 milliliter من المزرعة مركزياً عند 12,000 ×g لمدة دقيقة واحدة، واستخدام 1 milliliter من محلول PBS المعقم بتركيز 0.3% v/v من β-mercaptoethanol لغسل الراسب ثلاث مرات. يتم قياس الكثافة الضوئية عند OD 600، واستخدام polyvinyl perone 40 أو PVP 40 بتركيز 2% w/v في محلول PBS لتخفيف المعلق البكتيري حتى تصبح قيمة OD 600 مساوية لـ 0.3 أو 1 × 10⁸ CFUs per milliliter.

لتحضير اللقاح البكتيري، اعزل عدة مستعمرات فردية من سلالة M. meum M أو E 11 التي تعبر بشكل مستقر عن ناقل PS MT 3M cherry من وسط Middlebrook 7H10، ثم قم بتهوية وتلقيح 10 milliliters من مرق Middlebrook 7H9 الذي يحتوي على 10% volume per volume من Middlebrook ADC enrichment المدعم بـ 50 micrograms per milliliter من hygromycin، واحضن المزرعة طوال الليل عند 28 degrees Celsius. وفي اليوم التالي، قم بطرد 1 milliliter من المزرعة مركزياً عند 12,000 GS لمدة دقيقة واحدة، واستخدم 1 milliliter من PBS المعقم بتركيز 0.3% volume per volume من Tween 80 لغسل الراسب ثلاث مرات.

قس الكثافة الضوئية OD 600 للمعلق البكتيري، ثم خففه باستخدام 2% وزن/حجم من PVP 40 في محلول PBS للوصول إلى كثافة ضوئية OD 600 تبلغ 0.3 أو 0.3 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة (CFUs) لكل ملليلتر. وللحصول على بيوض سمك الزيبرا، ضع في الليلة السابقة لعملية الجمع ما لا يزيد عن 50 أنثى من سمك الزيبرا في الحجرة السفلية من وعاء تزويج كبير، و70 ذكراً في الجزء العلوي من الوعاء. وفي صباح اليوم التالي، قم بإزالة الفاصل من الوعاء. وبعد مرور ساعة واحدة تقريباً، اجمع البيوض عبر مجمع البيوض الموجود في قاع وعاء التزويج في أنبوب سعة 50 ملليلتر مملوء بماء البيض.

بعد تحضير أطباق الحقن، وفقاً للبروتوكول النصي الموجود في برنامج تشغيل المحقن الدقيق الآلي، انقر على معايرة المنصة (calibrate stage)، ثم انقر على شبكة الآبار 10 24 (10 24 Well grid) وضع طبق aros في المحقن الدقيق، وقم بمعايرة الطبق بالنقر على الشاشة عند الموضع المركزي للبئر. بعد ذلك، انتقل إلى قائمة الإبرة وانقر على معايرة حامل الإبرة (calibrate needle holder).

باستخدام رأس شاحن دقيق، املأ إبرة حقن ذات رأس بقطر 10 ميكرون إما بـ 10 µL من PVP 40 الذي يحتوي على 100 CFUs لكل نانولتر من S epiderm، أو 30 CFUs لكل نانولتر من erum، أو PVP 40 وحده لعمليات الحقن الصورية، ثم ضع الإبرة في المحقن الدقيق الآلي وقم بمعايرة الموضع XY عن طريق خفض الإبرة أو تحريكها للأعلى والنقر على الشاشة عند موضع الإبرة. بعد ذلك، قم بمعايرة الموضع Z للإبرة بالنقر على الشاشة عند موضع رأس الإبرة. تالياً، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لتوزيع البيض فوق شبكة aros وإزالة أي مياه زائدة من البيض.

بعد ذلك، ضع شبكة agros المملوءة بالبويضات في المحقن الدقيق الآلي في قائمة الحقن، واضبط إعداد ضغط الحقن على 200 hectare pascals ووقت الحقن على 0.2 seconds، وضغط التعويض على 15 Hector Pascals، وهو ما يعادل one nanoliter في قائمة إعدادات Femto jet. انقر فوق "inject all" لحقن لوحة الأجنة بالكامل، وبعد الحقن، قم بجمع البويضات عن طريق غسلها في طبق بتري وحضنها عند 28 °C.

بمجرد إعداد جهاز قياس التدفق الخلوي للجزيئات الكبيرة، ادخل إلى قائمة PMT واضبط القناة الحمراء على 650 volts والقناتين الخضراء والصفراء على zero volts. ثم ضمن قائمة العتبات، اضبط إشارة عتبة الكثافة الضوئية على 50، بما يتوافق مع 975 millivolts، والحد الأدنى لزمن الطيران على 800، بما يتوافق مع 320 microseconds. ومن أجل تقليل تأثير الحطام، ضع الأجنة في كوب العينة، وفي قائمة الفرز، حدد الحد الأقصى بـ 70 جنينًا لكل لوحة ليتم فرزها عن طريق إدخال 70.

ضع طبق بتري فارغاً أسفل جهاز الفرز وانقر على الفرز اليدوي. وعندما يمتلئ طبق بتري، احفظ البيانات بالنقر على تخزين. وفي حال تطلب الأمر تحليلاً أو تصويراً عالي الدقة، يمكن فرز الأجنة بشكل فردي في آبار صفيحة ذات 96 بئراً.

ضع الأجنة في كوب العينة وحدد جنينًا واحدًا كحد أقصى لكل بئر سيتم فرزه. ثم ضع طبقًا فارغًا مكونًا من 96 بئرًا في حامل الأطباق الأيسر وانقر على ملء الطبق. وعندما يتم ملء الطبق، احفظ البيانات بالنقر على تخزين لتحليل الأجنة المعالجة بالعقار بعد ثلاثة أيام من الحقن باستخدام erum.

عالج مجموعة واحدة من الأجنة بمركب الدراسة المذاب في المذيب، وعالج مجموعة ثانية بالمذيب وحده. ضع الأجنة المعالجة في اليومين الرابع والخامس بعد الإخصاب في كوب العينات بجهاز قياس التدفق الخلوي، واضبط عملية الفرز على 70 جنيناً لكل لوحة بعد تخدير الأجنة في trica، وإعداد نظام الفحص الآلي للفقاريات وأداة أخذ عينات الجسيمات الكبيرة. ووفقاً للبروتوكول النصي من قائمة إعداد الكشف عن الأجسام التصويرية، اختر الصور المرجعية المقابلة لعمر الأجنة من قائمة التخزين التلقائي للصور التصويرية، ثم حدد عدد الصور المراد إنشاؤها والاتجاه المراد استخدامه.

ضع طبقاً يحتوي على 96 بئراً مملوءة بالأجنة في حامل الأطباق الأيسر بجهاز أخذ عينات الجسيمات الكبيرة، ثم انقر فوق "تشغيل الطبق" (run plate). عندما يتم وضع الجنين في الموضع الصحيح، استخدم عدسة شيئية جافة بسيطة بقوة 10x لتصوير الرأس والذيل بشكل منفصل. بعد ذلك، استخدم برنامج معالجة الصور لدمج الصور معاً لتقييم المرحلة التنموية الأنسب للعدوى في المحّ.

تم إجراء الحقن باستخدام dermitis و marum في جميع المراحل المختلفة بين مرحلة الخلية الواحدة ومرحلة 512 خلية. وكما هو موضح هنا، فإن الحقن بـ 100 CFU من dermitis والتي أُجريت بين مرحلتي 16 و 128 خلية قد وفرت أفضل نمط للعدوى. تكاثرت البكتيريا داخل المحّ لمدة ثلاثة أيام وانتشرت في الجسم بدءاً من اليوم الثالث بعد العدوى فصاعداً.

تم إجراء تقدير كمي عالي الإنتاجية للحمل البكتيري عن طريق تحليل شدة الفلورسنت باستخدام مقياس التدفق الخلوي للجزيئات الكبيرة. وكما هو موضح هنا، فإن كمية البكتيريا الحية الموجودة داخل الجنين تتوافق بشكل جيد جداً مع إشارة الفلورسنت المقاسة. يوضح هذا الشكل أن المرحلة التطورية المثلى لحقن 30 CFUs من aminum هي ما بين مرحلة 16 و 128 خلية لسلالة E 11، وما بين مرحلة 16 و 64 خلية.

أظهرت الأجنة التي حُقنت بسلالة EM الأكثر ضراوة في هذه المراحل نموًا بكتيريًا داخل البلوط وانتشارًا للبكتيريا عبر الجنين. وبعد المعالجة المسبقة للأجنة المصابة بـ emerin بتركيزات مختلفة من rifampicin، لوحظ انخفاض في العدوى بالميكوبكتيريا بطريقة تعتمد على الجرعة. وأثبت استخدام العقار بجرعة 200 micromolar أنه أوقف بفعالية تطور البكتيريا M mein E 11، وذلك بعد 24 ساعة وما بعدها من العلاج بعد تطورها.

لقد مهدت هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال اختبار المركبات وتطوير الأدوية، الذين يبحثون عن علاجات جديدة للأمراض المعدية مثل السل أو العدوى المرتبطة بالمواد الحيوية.