الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة
أغسطس 7, 2014
ووضعت دوامة ميكروفلويديك منصة Electroporation للمساعدة للتسليم متتابعة من الجزيئات متعددة في السكان الخلية متطابقة مع التحكم جرعة دقيقة ومستقلة. حجم استنادا خطوة تنقية الخلية المستهدفة Electroporation للسبقت النظام ساعد على تعزيز كفاءة تسليم الجزيئية وبقاء الخلية المصنعة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم أنواع مختلفة من الجزيئات ذات المغزى بيولوجيا بطريقة متسلسلة ويمكن التحكم فيها بالجرعات بكفاءة عالية باستخدام مسام الموائع الدقيقة بمساعدة Vortex ، ويتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر بشكل فردي تحتوي على محاليل DPBS مع الخلايا والجزيئات الحيوية ، وربط كل أنبوب بحامل القارورة الخاص به المتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي. الخطوة الثانية هي إدخال أنابيب المدخل من كل قارورة في جهاز الموائع الدقيقة باستخدام الأقطاب الكهربائية المكونة من 15 سنا. بعد ذلك ، يتم تدفق الخلايا إلى الجهاز حيث يتم احتجازها في دوامات دقيقة تشكلت في غرف التثقيب الكهربائي.
الخطوة الأخيرة هي تطبيق نبضات كهربائية قصيرة على الخلايا المحاصرة على الفور متبوعة بحقن المحاليل التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ليتم تسليمها إلى العصارة الخلوية. في النهاية ، يمكن إطلاق الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه العملية وجمعها لتحليلها في اتجاه المصب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن التقنية المقترحة قادرة على توصيل كمية خاضعة للرقابة بالتتابع من جزيئات متعددة إلى مجموعة خلايا متطابقة محددة مسبقا بكفاءة عالية وقابلية للبقاء.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تبادل السوائل لأن توقيت خطوة التدفق البارد في كل محلول. تحدد خطوة التبديل استقرار التراكب اللوني للخلية. سيتم استخدام خط خلية سرطان الثدي النقيلي M-D-A-M-B 2 31 في لوحة التجربة هذه مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر بحجم 10 ملليلتر لكل T 75 قارورة زراعة الأنسجة في وسط Leibovitz's L 15 مكمل بنسبة 10٪ حجم لكل حجم ، ومصل بقري للجنين ، و 1٪ بنسلين.
يحتضن الستربتومايسين الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع بيئة 0٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد يومين من البذر ، حصاد الخلايا للتجارب. بعد غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن لفوسفات بوكوس أو DPBS ، عالج الخلايا بنسبة 0.25٪ تريبسين في EDTA لمدة دقيقتين.
أضف ثمانية ملليلتر من وسائط النمو لتعطيل خلايا الحبيبات ذات النشاط الأنزيمي عن طريق الترقي لمدة خمس دقائق عند 200 مرة G والوسائط المعلقة إلى تركيز نهائي من خمسة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. لن يتم عرض تصميم وتصنيع جهاز التثقيب الكهربائي للموائع الدقيقة في هذا الفيديو ، ولكن تم وصفه في المخطوطة المصاحبة. يتكون النظام من مداخل للخلايا والجزيئات ومحلول التدفق.
قناتان مستقيمتان حيث يحدث التركيز بالقصور الذاتي. 10 غرف للتثقيب الكهربائي مع أقطاب كهربائية ومخرج لإعداد تجارب التدفق. أدخل منفذا أو بولي إيثر أو كيتون الأثير أو أنبوب الذروة ، وقطب الألمنيوم المكون من 15 سنا للنبض القصير ، وتطبيق الجهد العالي في الأماكن المحددة عبر الفتحات الموجودة في القناة الدقيقة.
يتكون القطب الكهربائي المكون من 15 سنا من 10 أقطاب كهربائية موجبة وخمسة أقطاب كهربائية سالبة. يفصل كل قطب موجب مسافة 1.5 ملم عن القطب السالب ، وكل قطب كهربائي من نفس القطبية متباعدة بمقدار 1.35 ملليمتر. قم بتوصيل المعدات الكهربائية لتوليد نبضات الموجة المربعة القصيرة عالية الجهد بأقطاب الألمنيوم الملامسة للمحاليل المتدفقة.
في قالب PDMS ، يجب أن تتكون المعدات من مولد نبض ومضخم جهد عالي مدمج. قم بإعداد أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 مليلتر تحتوي بشكل فردي على DPBS ومحاليل بالخلايا والجزيئات. قم بتوصيل كل أنبوب بحامل القارورة الخاص به المتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي.
قم بتوصيل أنابيب ذروة المدخل من حاملات القارورة بفتحات المدخل المعنية في جهاز الموائع الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتعيينه. حجم نبضات الموجة المربعة فولت إلى 100 فولت.
من أجل أن تكون شدة المجال الكهربائي عبر غرفة التثقيب الكهربائي مكافئة ل 0.7 كيلو فولت لكل سنتيمتر. اضبط منظم الضغط على 40 PSIA يتم استخدام مصدر نيتروجين فردي قابل للتعديل يدويا للضغط بشكل موحد على جميع قوارير العينة ويستخدم مشعبا عالي السرعة لتنشيط منافذ المحلول الفردية في الوقت المناسب. باستخدام برنامج عرض المختبر المصمم خصيصا للتحكم في الصمام.
افتح برنامج عرض المختبر المسمى مشغل الصمامات وانقر فوق تشغيل من القائمة المنسدلة بعنوان تشغيل. انقر فوق صمام رمز الصمام المقابل واحد لفتح الصمام لخزان DPBS لتجهيز سرعة التدفق المطلوبة لتوليد دوامة محاصرة الخلايا المستقرة لمدة 1.5 دقيقة. يجب أن تتحول أيقونة الصمام من الرمادي إلى الأخضر عند تنشيط التدفق ، كل من حلول الغسيل والخلايا من خلال الجهاز في وقت واحد لمدة 10 ثوان قبل خطوة محاصرة الخلية.
لضمان التدفق غير المنقطع أثناء خطوة تبديل الحل، يجب تكرار خطوة التدفق المشترك الموجزة هذه في كل خطوة تبديل الحل. قم بتبديل منفذ المحلول النشط من محلول الغسيل إلى محلول الخلية لاحتجاز الخلايا في حجرة التثقيب الكهربائي لمدة 30 ثانية. في هذا الفيلم ، تمثل إشارات الفلورسنت الزرقاء خطافات قابلة للحياة.
3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 5 خلايا مرحلة. قم بتشغيل منفذ الغسيل وشطف الجهاز لمدة 20 ثانية. من أجل إزالة الخلايا الملوثة غير المحاصرة ، يتدفق المحلول الذي يحتوي على الجزيء الأول ذي الأهمية.
يوديد البروبيديوم في الجهاز لأغراض التصور. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام أصباغ الحمض النووي بدلا من خيوط DExT الموسومة بالفلورسنت بسبب نسبة الضوضاء إلى الإشارة الفائقة للأصباغ ، وتطبيق خمس نبضات قصيرة على الفور بعد حقن المحلول الجزيئي ، ومراقبة حجم وعدد النبضات الكهربائية المطبقة في الوقت الفعلي باستخدام راسم الذبذبات ، ويمكن تصور إشارات الفلورسنت للجزيئات تحت المجهر ، احتضان الخلايا لمدة 100 ثانية في المحلول الجزيئي. التدفق التالي ، المحلول الذي يحتوي على الجزيء الثاني ، صبغ الحمض النووي يويو واحد في الجهاز.
في هذا العرض التوضيحي ، يتم تسليم الجزيء الثاني دون تطبيقات نبضية كهربائية إضافية. يؤكد هذا الفيلم أن الخلايا تعبر الآن عن جميع إشارات الفلورسنت الثلاث. أخضر لليويو ، واحد ، أحمر للبروبيديوم ، يوديد ، وأزرق للخطافات.
3 ، 3 ، 3 ، 4 ، 5. حرر الخلايا في لوحة 96 بئر لتحليلها في اتجاه مجرى النهر عن طريق خفض ضغط التشغيل إلى أقل من خمسة رطل لكل بوصة مربعة. يتم جمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من المحلول مع 100 خلية من كل إصدار.
يجب تكرار إجراء التثقيب الكهربائي ثلاث مرات على الأقل لجمع خلايا كافية لجهاز الطرد المركزي لقياس التدفق الخلوي. تحتوي لوحة البئر 96 على خلايا معالجة عند 228 مرة G لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على جزيئات الفلورسنت الزائدة وأعد تعليق الخلايا في DPBS.
إذا تم تسليم خيوط DExT الموسومة بالفلورسنت ، تحليل الخلايا لاحقا لامتصاص الجزيئ. الكفاءة عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تحديد التسليم الجزيئي الناجح نوعيا من خلال مراقبة التغيرات في شدة التألق للخلايا المدارية المدارية الكهربائية في C two ، مما أكد أن 90٪ من الخلايا المعالجة تمتص 70،000 دالتون ، وهو جزيء حبلا DExT أيوني.
لمتختلف كفاءة كل جزيء ديكستران تم نقله على أنه نسبة عدد الخلايا التي تمتص بنجاح الجزيء محل الاهتمام إلى العدد الإجمالي للخلايا المعالجة بشكل كبير اعتمادا على الوزن الجزيئي أو الشحنات الكهربائية. تم تسليم جميع جزيئات ديكستران المختبرة إلى العصارة الخلوية بكفاءة تزيد عن 70٪ كما هو موضح هنا ، ملامح قياس التدفق الخلوي التمثيلية للخلايا التي لم يتم معالجتها بالتثقيب الكهربائي. يتم تعيين عتبة الفلورسنت التي تشير إلى التسليم الجزيئي الناجح من البيانات بحيث يتم العثور على الإشارات من عينات التحكم تحت العتبة.
تعرض بيانات قياس التدفق الخلوي التمثيلية هذه للخلايا المثقبة بالكهرباء بالتتابع مخطط قياس التدفق الخلوي بجوار صور خط الفلورسنت ، وتمثل المربعات الخضراء إشارات من الخلايا التي تمتص 3000 ، ودالتون ديكستران محايد فقط ، وتمثل المربعات الحمراء إشارات من الخلايا. امتصاص 3000 دالتون ، وهو خيط DExT أيوني ، فقط إشارات الفلورسنت من الخلايا التي تمتص ، يشير كل من جزيئات حبلا DExT الموضحة باللون الأصفر إلى كفاءة توصيل جزيء مزدوج بنسبة 56٪ بعد تطويره. ستكون هذه التقنية مفيدة للباحثين في مجال الطب والتكنولوجيا الحيوية وعلم الأدوية لاستكشاف مزيج من الكواشف العلاجية لتحقيق تأثيرات تآزرية في علاج الأمراض المعقدة.
لا تنس أن العمل مع النبضات الكهربائية عالية الجهد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ضمان تأريضك أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تمكن منصة الإلكتروبورات المدعومة بدوامات ميكروية من التسليم المتسلسل لجزيئات متعددة إلى مجموعات خلوية متطابقة مع تحكم دقيق في الجرعة. تعمل هذه الطريقة على تحسين كفاءة توصيل الجزيئات مع الحفاظ على حيوية الخلية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الميكروية
- الإلكتروبورات
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- الإلكتروبورات هي تقنية تُستخدم لإدخال الجزيئات إلى الخلايا.
- تسمح الأجهزة الميكروية بالتحكم الدقيق في تدفق السوائل ومعالجة الخلايا.
- التسليم المتسلسل للجزيئات الحيوية يمكن أن يحسن النتائج التجريبية.
- الحفاظ على حيوية الخلية خلال العملية أمر بالغ الأهمية للتطبيقات اللاحقة.
غرض الدراسة
- تطوير منصة للتسليم المتحكم به لجزيئات حيوية متعددة.
- تعزيز كفاءة توصيل الجزيئات إلى الخلايا.
- ضمان حيوية عالية للخلايا بعد الإلكتروبورات.
الطرق المستخدمة
- تحضير محاليل DPBS مع الخلايا والجزيئات الحيوية.
- استخدام نظام التحكم في التدفق الهوائي لتوصيل السوائل.
- تكوين دوامات مصغرة في غرف الإلكتروبورات.
- تطبيق نبضات كهربائية قصيرة لتسهيل امتصاص الجزيئات.
النتائج الرئيسية
- تسليم ناجح لجزيئات حيوية متعددة إلى الخلايا.
- كفاءة عالية وحيوية للخلايا المعالجة.
- القدرة المثبتة على التسليم المتسلسل والجرعة المتحكم بها.
- إمكانية التحليل اللاحق للخلايا المعالجة.
الاستنتاجات
- توفر المنصة المتقدمة تطورًا كبيرًا في تقنيات توصيل الجزيئات.
- تسمح بالتحكم الدقيق في جرعة وتوقيت توصيل الجزيئات الحيوية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في دراسات بيولوجية مختلفة تتطلب حيوية عالية للخلايا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This microfluidic electroporation platform addresses the need for precise, sequential delivery of multiple biomolecules into homogeneous cell populations, a critical capability for combination therapy screening and mechanistic de-risking in early discovery. By enabling real-time visualization and in situ parameter adjustment, the system enhances predictive confidence in molecular uptake efficiency while maintaining high viability, supporting reliable go/no-go decisions in target validation workflows. The technology’s ability to deliver charged and neutral macromolecules with consistent efficiency (>70%) across molecular weights provides a scalable, reproducible foundation for assay development in oncology and pharmacology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of combinatorial molecular effects on metastatic breast cancer cells through sequential, dosage-controlled delivery of dextran molecules with varying size and charge.
- Operational Value: Isolates uniform cell populations via microscale vortices, reducing variability in electroporation efficiency and enhancing reproducibility across replicates.
- Predictive Value: Real-time fluorescence monitoring allows immediate optimization of pulse parameters, improving delivery efficiency and data quality for downstream functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized, electroporated cell samples suitable for flow cytometry-based quantification of molecular uptake, enabling robust assay readouts.
- Operational Value: Integrates pneumatic flow control and valve automation for consistent fluid exchange, supporting high-throughput sequential molecule delivery campaigns.
- Scalability: Platform design allows reuse across multiple experimental runs with minimal variation, supporting enterprise-level assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains high cell viability post-electroporation, ensuring recovered cells are suitable for downstream analysis such as flow cytometry and functional validation.
- Mechanistic De-risking: Enables controlled testing of molecular combinations to assess synergistic or antagonistic effects, reducing uncertainty in lead combination selection.
- Predictive Confidence: Demonstrated >70% delivery efficiency for both 3,000 and 70,000 Da dextran molecules supports reliable extrapolation to therapeutic macromolecules in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where sequential biomolecule delivery enables systematic evaluation of combination effects on disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular synergy by enabling precise, sequential delivery of probes to identical cell populations under controlled conditions.
- Screening: Delivers quantitative, fluorescence-based uptake metrics that allow comparison of molecular efficiency across varying physicochemical properties.
- Analytics: Generates measurable outputs (uptake efficiency, fluorescence intensity) suitable for statistical analysis and hit selection in screening campaigns.
- Translational Research: Preserves cell integrity for functional assays, bridging discovery findings to preclinical evaluation of molecular combinations.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular fluidic system adaptable to various biomolecules and cell types, supporting repeated use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in combination studies by enabling controlled, sequential delivery of multiple agents to uniform cell populations.
- Operational Value: Ensures reproducibility through precise flow control, vortex-based trapping, and real-time visualization, minimizing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing success rates in molecular delivery experiments, reducing wasted reagents and failed runs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of molecular combinations based on validated delivery efficiency and cellular response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system operation, high-voltage pulse generation, and fluorescent microscopy for real-time monitoring.
- Depends on pneumatic flow control systems, pulse generators, high-voltage amplifiers, and oscilloscopes for precise electrical and fluidic control.
- Necessitates standardization of valve timing, pressure settings, and pulse parameters across users to ensure reproducible vortex formation and electroporation efficiency.
- Adaptation to different cell types may require optimization of flow rates, trapping duration, and pulse parameters based on cell size and membrane properties.
- Practical limitations include the need for careful handling of high-voltage components and potential shear stress on sensitive cell types during vortex formation.
