الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إيصال أنواع مختلفة من الجزيئات ذات الدلالة البيولوجية بطريقة متسلسلة وبجرعات يمكن التحكم بها وبكفاءة عالية باستخدام مسامي الموائع الدقيقة المدعوم بالدوامات؛ ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter تحتوي كل منها على محلول DPBS مع الخلايا والجزيئات الحيوية، وتوصيل كل أنبوب بحامل القارورة المخصص له والمتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي. وتتمثل الخطوة الثانية في إدخال أنابيب الإدخال من كل قارورة في جهاز الموائع الدقيقة الذي يحتوي على أقطاب كهربائية مدمجة مكونة من 15 pin. بعد ذلك، تتدفق الخلايا إلى الجهاز حيث يتم حجزها في دوامات دقيقة المقياس تتشكل في غرف التثقيب الكهربائي.

تتمثل الخطوة النهائية في تسليط نبضات كهربائية قصيرة على الخلايا المحتجزة، يتبع ذلك مباشرةً حقن المحاليل التي تحتوي على الجزيئات الحيوية المراد إيصالها إلى السيتوسول. وفي النهاية، يمكن تحرير الخلايا التي تم الحصول عليها من هذه العملية وجمعها لإجراء التحليلات اللاحقة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في قدرتها على إيصال كميات محكومة من جزيئات متعددة بشكل متتابع إلى مجموعة خلايا متطابقة ومحددة مسبقاً، وذلك بكفاءة وقابلية حياة عالية.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات تبديل السوائل نظراً لأن توقيت خطوة التدفق البارد عند كل مرحلة تبديل للمحلول يحدد مدى استقرار احتجاز الخلايا. سيتم استخدام خط خلايا سرطان الثدي النقيلي M-D-A-M-B 2 31 في هذه التجربة بكثافة 1 × 10⁵ خلية/مل في حجم 10 مل لكل قارورة زراعة أنسجة T 75 في وسط Leibovitz's L 15 مضاف إليه 10% (حجم/حجم) من مصل جنين البقر و1% بنسيلين.

يتم تحضين الخلايا في حاضنة رطبة عند 37 درجة Celsius في بيئة تحتوي على 0% من ثاني أكسيد الكربون مع إضافة Streptomycin. وبعد يومين من عملية الاستزراع، تُجمع الخلايا لإجراء التجارب. وبعد غسل الخلايا باستخدام phosphate buffered saline أو DPBS، تُعامل الخلايا بـ 0.25% trypsin EDTA لمدة دقيقتين.

أضف ثمانية ملليلترات من وسط النمو لإيقاف النشاط الإنزيمي لخلايا الراسب عبر الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 ×g، ثم أعد تعليقها في الوسط بتركيز نهائي قدره 5 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر. لن يتم عرض تصميم وتصنيع جهاز التثقيب الكهربائي الموائع الدقيقة في هذا الفيديو، ولكن تم وصفه في المخطوطة المرفقة. يتكون النظام من مداخل للخلايا والجزيئات ومحلول شطف.

قناتان مستقيمتان حيث يحدث التركيز العطالي. 10 غرف تثقيب كهربائي تحتوي على أقطاب كهربائية ومخرج للتجهيز لتجارب التدفق. أدخِل مخرجاً، أو أنبوباً من مادة بولي إيثر إيثر كيتون (PEEK)، والقطب الكهربائي المصنوع من الألومنيوم المكون من 15 دبوساً لتطبيق جهد عالٍ بنبضات قصيرة في الأماكن المخصصة عبر الثقوب الموجودة في القناة الدقيقة.

يتكون القطب الكهربائي المكون من 15 دبوساً من 10 أقطاب موجبة وخمسة أقطاب سالبة. تفصل مسافة 1.5 millimeters بين كل قطب موجب وقطب سالب، بينما تفصل مسافة 1.35 millimeters بين كل قطبين من نفس القطبية. قم بتوصيل المعدات الكهربائية المخصصة لتوليد نبضات موجية مربعة قصيرة ذات جهد عالٍ بالأقطاب المصنوعة من الألومنيوم والتي تكون ملامسة للمحاليل المتدفقة.

في قالب PDMS، يجب أن تتكون المعدات من مولد نبضات ومضخم جهد عالٍ مُصنع داخلياً. قم بتحضير أربعة أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter تحتوي كل منها على DPBS ومحاليل تحتوي على خلايا وجزيئات. ثبّت كل أنبوب في حامل القارورة الخاص به والمتصل بنظام التحكم في التدفق الهوائي.

قم بتوصيل أنابيب الذروة للمدخل من حوامل القوارير إلى فتحات المدخل المقابلة في الجهاز الموائع الدقيقة. بعد ذلك، اضبط مقدار نبضات الموجة المربعة على 100 volts.

لجعل شدة المجال الكهربائي عبر غرفة التثقيب الكهربائي تعادل 0.7 kilovolts per centimeter، يتم ضبط منظم الضغط على 40 PSIA. ويُستخدم مصدر نيتروجين واحد قابل للتعديل يدويًا لضغط جميع قوارير العينات بشكل موحد، مع استخدام مجمع عالي السرعة لتنشيط منافذ المحاليل الفردية في الوقت المحدد، وذلك باستخدام برنامج LabVIEW مصمم خصيصًا للتحكم في الصمامات.

افتح برنامج lab view المسمى valve runner وانقر على run من القائمة المنسدلة التي تحمل عنوان Operate. انقر على أيقونة الصمام المقابلة valve one لفتح الصمام الخاص بخزان DPBS لتهيئة سرعة التدفق المطلوبة لتوليد الدوامات اللازمة لاحتجاز الخلايا بشكل مستقر لمدة 1.5 minutes. يجب أن يتغير لون أيقونة الصمام من الرمادي إلى الأخضر عند تفعيله؛ قم بتمرير كل من محاليل الغسيل ومحاليل الخلايا عبر الجهاز في آن واحد لمدة 10 seconds قبل خطوة احتجاز الخلايا.

لضمان تدفق غير منقطع أثناء خطوة تبديل المحلول، يجب تكرار خطوة التدفق المشترك القصيرة هذه عند كل خطوة تبديل للمحلول. قم بتحويل منفذ المحلول النشط من محلول الغسيل إلى محلول الخلايا لحجز الخلايا في غرفة التثقيب الكهربائي لمدة 30 seconds. في هذا المقطع المرئي، تمثل الإشارات الفلورية الزرقاء الخطافات الحيوية.

خلايا في المراحل 3، 3، 3، 4، 5. قم بتشغيل منفذ الغسيل واغسل الجهاز لمدة 20 ثانية. ومن أجل إزالة الخلايا الملوثة غير المحتجزة، قم بتمرير المحلول الذي يحتوي على الجزيء الأول المستهدف.

يوديد البروبيديوم في الجهاز لأغراض التصوير. في هذا العرض التوضيحي، تُستخدم صبغات الأحماض النووية بدلاً من خيوط DExT الموسومة بفلوروفورات نظراً لنسبة الإشارة إلى الضوضاء المتفوقة لهذه الصبغات؛ يتم تطبيق خمس نبضات قصيرة فور حقن المحلول الجزيئي، ومراقبة مقدار وعدد النبضات الكهربائية المطبقة في الوقت الفعلي باستخدام جهاز أوسيلوسكوب، ويمكن تصوير الإشارات الفلورية للجزيئات تحت المجهر، ثم تُحضن الخلايا لمدة 100 ثانية في المحلول الجزيئي. بعد ذلك، يتم تدفق المحلول الذي يحتوي على الجزيء الثاني، وهو صبغة الحمض النووي yo-yo one، إلى داخل الجهاز.

في هذا العرض التوضيحي، يتم إيصال الجزيء الثاني دون تطبيق نبضات كهربائية إضافية. ويؤكد هذا المقطع المرئي أن الخلايا تعبر الآن عن جميع الإشارات الفلورية الثلاث؛ اللون الأخضر لـ yo-yo, one، والأحمر لـ propidium, iodide، والأزرق لـ hooks.

3، 3، 3، 4، 5. قم بتحرير الخلايا في طبق ذي 96 بئراً لإجراء التحليلات اللاحقة عن طريق خفض ضغط التشغيل إلى أقل من 5 PSI. يتم جمع حوالي 100 µL من المحلول الذي يحتوي على 100 خلية من كل عملية تحرير.

يجب تكرار إجراء التثقيب الكهربائي ثلاث مرات على الأقل لجمع عدد كافٍ من الخلايا لجهاز قياس التدفق الخلوي. يتم طرد الخلايا المعالجة في صفيحة ذات 96 بئرًا عند 228 ×g لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، يُزال الطافي الذي يحتوي على الجزيئات الفلورية الزائدة ويُعاد تعليق الخلايا في DPBS.

في حال تسليم خيوط DExT الموسومة فلوريسنتياً، يتم تحليل الخلايا لاحقاً للتحقق من الامتصاص الجزيئي. وتُقاس الكفاءة بواسطة قياس التدفق الخلوي. وقد تم تحديد نجاح التسليم الجزيئي نوعياً من خلال مراقبة التغيرات في شدة الفلورة للخلايا المدارية التي خضعت للتثقيب الكهربائي في C two، مما أكد أن 90% من الخلايا المعالجة امتصت جزيء خيط DExT أيوني بوزن 70, 000 Dalton.

لم تختلف كفاءة كل جزيء ديكستران منقول، والتي عُرِّفت بأنها نسبة عدد الخلايا التي امتصت الجزيء المستهدف بنجاح إلى إجمالي عدد الخلايا المعالجة، بشكل ملحوظ بناءً على الوزن الجزيئي أو الشحنات الكهربائية. وقد تم إيصال جميع جزيئات الديكستران المختبرة إلى العصارة الخلوية بكفاءة تتجاوز 70%. يظهر هنا ملف تعريف قياسي لقياس التدفق الخلوي للخلايا التي لم يتم علاجها بالتثقيب الكهربائي. وقد تم تحديد عتبة الفلورة التي تشير إلى نجاح إيصال الجزيئات من البيانات بحيث تكون الإشارات الواردة من عينات التحكم أدنى من هذه العتبة.

تعرض بيانات قياس التدفق الخلوي التمثيلية هذه للخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي المتسلسل مخطط قياس التدفق الخلوي بجانب صور الخطوط الفلورية؛ حيث تمثل المربعات الخضراء الإشارات الصادرة عن الخلايا التي امتصت الديكستران المتعادل بوزن 3000 Dalton فقط، وتمثل المربعات الحمراء الإشارات الصادرة عن الخلايا التي امتصت سلسلة DExT أيونية بوزن 3000 Dalton، بينما تشير الإشارات الفلورية الصفراء الصادرة عن الخلايا التي امتصت كلا جزيئي سلسلة DExT إلى كفاءة توصيل مزدوجة للجزيئات بلغت 56%. وبعد تطويرها، ستكون هذه التقنية مفيدة للباحثين في مجالات الطب، والتكنولوجيا الحيوية، وعلم الصيدلة لاستكشاف مزيج من الكواشف العلاجية لتحقيق تأثيرات تآزرية في علاج الأمراض المعقدة.

لا تنسَ أن العمل بالنبضات الكهربائية ذات الجهد العالي يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل التأكد من التأريض، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.