طعنة الإصابة بالجروح من اسماك الزرد الكبار الدماغ الانتهائي: طريقة المعنية بالتحقيق في تكوين الخلايا العصبية والدماغ الفقارية التجديد

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في الاستجابة الخلوية والآليات الجزيئية المشاركة في تكوين الخلايا العصبية للبالغين وتجديد الجهاز العصبي المركزي وإصلاحه. في أسماك الزرد ، يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق إحداث إصابة يدويا عن طريق ثقب نصف الكرة الأرضية الأيمن لأسماك الحمار الوحشي البالغة. بعد ذلك بعد خمسة أيام من الإصابة ، يتم التضحية بالسمكة وتشريح دماغها وتضمينها في aros لتقطيعها في بعض الحالات.

ثم يتم تلطيخ أقسام الدماغ بالكيمياء المناعية أو في C اثنين من التهجين مع العلامات المناسبة. من أجل مراقبة تكاثر الخلايا ، يتم الحصول على نتائج الخلايا الدبقية ، وعدم التكوين ، وتكوين الخلايا العصبية التي تظهر تنظيم علامة التكاثر ، PCNA ، وعلامة الدبقية الراديوية S 100 beta و oli اثنين من EGFP تسمى خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن المسماة في منطقة البطين عند جرح الطعنة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية تمس النهج المعدلة وراثيا لإنتاج استئصال محدد للأنسجة أو نوع الخلية هي بساطتها وسرعتها وكفاءتها ، مما يسمح بإنتاج العديد من الأدمغة المصابة في وقت قصير.

بعد تخدير أسماك الحمار الوحشي البالغة ، وفقا لبروتوكول النص ، ضع الأسماك الفردية في شق في كتلة من المناديل الورقية المبللة بالتريكا تحت مجهر تشريح مع ضوء من الأعلى. أمسك السمكة برفق بيد واحدة ووجهها بطريقة تسمح بالوصول إلى الرأس من الأعلى باستخدام حقنة مجهزة بإبرة قياس 30. من ناحية أخرى ، ادفع الإبرة عموديا عبر الجمجمة ، لا يزيد عمقها عن ملليمترين في المنطقة الإنسية لنصف الكرة الأرضية الرأسي.

بعد إدخال إصابة الرأس ، ضع السمك في ماء السمك العذب. عند الانتهاء ، انقل الأسماك مرة أخرى إلى نظام تدفق المياه. بعد السماح للأسماك بالتعافي للفترة الزمنية المطلوبة والقتل الرحيم لها وفقا لبروتوكول النص ، قم بالتضحية بها على الجليد واستخدم مقصا حادا لقطع خلف الخياشيم لفصل الرأس عن الجسم.

احتضان الرؤوس في XPBS واحد لمدة خمس دقائق للسماح بالنزيف. ثم انقل الرؤوس إلى 4٪ من الفورمالديهايد في PBS واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة بعد التثبيت. استخدم XPBS واحد في طبق بتري لغسل الرؤوس مرتين.

ثم تحت مجهر تشريح ، قم بتشريح الأدمغة بعناية في PBS. تخلص من أي أدمغة بدون آفة مرئية. انقل الأدمغة إلى أنبوبين تفاعليين مليلترين مملوءين ب 1.5 ملليلتر من الميثانول بنسبة 100٪ واقلبي الأنابيب خمس مرات قبل احتضانها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 16 ساعة على الأقل.

لإعادة ترطيب الأنسجة من أجل الكيمياء المناعية ، احتضن الأدمغة لمدة خمس دقائق لكل منها في سلسلة ميثانول تنازلية قبل استخدام PBS tween 20 أو PTW لغسل الأدمغة خمس مرات. لمدة خمس دقائق لكل منهما. بجانب تضمين الأدمغة ، استخدم ماصة نقل لوضعها في تجاويف صينية أكواب صب البولي إيثيلين لإذابة 2٪ agros في XPBS واحد عن طريق تسخينه في ميكروويف عند 600 واط.

دع agros يبرد لمدة ثلاث دقائق قبل الاستخدام. ثم قم بإزالة PTW بعناية من دماغ واحد قبل استخدام aros لملء القالب بالكامل. استخدم إبرة التشريح لتدوير الدماغ في الشقوف لغسل PTW وتوجيه الدماغ مع الجانب البطني لأسفل الجانب الظهري لأعلى ووضعه بشكل مستقيم قبل ترك agros يبرد.

باستخدام إبرة تشريح ، قم بإزالة كتلة agros من القالب. ثم باستخدام شفرة الحلاقة الحادة ، قم بقطع agros بالتوازي مع cephalon في الطرف الخلفي من الدماغ. الآن قم بقص agros في الطرف الأمامي من الدماغ قبل قلب الكتلة بحيث تقف على المستوى الخلفي.

قم بإزالة الكمية الزائدة عن طريق إجراء جروح موازية للجانبين الظهري والبطني للدماغ. ثم اقلب الدماغ للخلف بحيث يقع على جانبه البطني. أخيرا ، قم بقص الكتلة إلى مثلث مقطوع يقع فيه الرأس في المستوى الأصغر.

بعد تحضير الفيوم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، استخدم XPBS واحد لملء الحمام العازل بحيث يصل إلى قاع الشفرة. بعد ذلك ، ضع نقطة صغيرة من الغراء الفائق في الجزء العلوي من قرص العينة للهزاز. ثم ضع بعناية مستوى الكتلة الموجود خلف الدماغ على الغراء الفائق.

استخدم مناور الميكروتوم لإدخال قرص العينة في الدرج المؤقت وتدوير قرص العينة إلى الموضع المطلوب. ثم استخدم مفتاح ألين بحجم ثلاثة ملليمترات لتشديد المسمار وإزالة المناور. ضع الكتلة في الحمام العازل بحيث يقع الرأس تحت السطح مباشرة مع الجانب الظهري من الدماغ في مواجهة الشفرة لتقسيم الدماغ.

قم بإعداد لوحة 24 بئر لجمع الأقسام عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت المانع لكل دماغ في آبار اللوحة باستخدام الميكروتوم الاهتزازي. ابدأ التقسيم بسماكة 50 ميكرومتر وسرعة ملليمتر واحد في الثانية وتردد 70 هرتز. باستخدام فرشاة اصطناعية ، التقط الشرائح الرقيقة من الحروس عندما تخرج من الشفرة واجمعها في لوحة 24 بئر.

لإجراء الكيمياء المناعية ، قم بحظر المواقع غير المحددة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت وأضف 250 ميكرولترا من الجسم المضاد المخفف في حضانة العازلة الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام PTW لغسل العينات ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها. بعد الحضانة والأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الأقسام ثلاث مرات. استخدم وسيط تركيب غير فلوري قابل للذوبان في الماء لتركيب الأقسام. ثم قم بتحليل العينات تحت مجهر مركب أو متحد البؤر.

عند إجراؤه بشكل صحيح ، يؤدي الجرح إلى قناة آفة تمتد من الظهرية إلى البطنية من خلال بلام الحكاية سيفالون التي ستلتئم بعد 35 يوما. تم عرضه سابقا باستخدام الكيمياء المناعية. يؤدي هذا الجرح إلى تنظيم PCNA و S 100 beta ونمط متداخل بعد ثلاثة إلى سبعة أيام من الآفة مما يشير إلى تكاثر الخلايا الدبقية الشعاعية.

يوضح هذا الشكل تراكما عابرا لخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن أو OPCs على مقربة من جرح طعنة ناتج في أوليج اثنين من أسماك EEG FP المعدلة وراثيا والتي لم تعد لوحظت بحلول اليوم 35 بعد الآفة. إذا لم يتم إدخال الآفة بشكل صحيح ، فلن تكون قناة الآفة مرئية. لا يمكن اكتشاف تنظيم PCNA و S 100 بيتا أو تراكم OPCs.

كما هو موضح هنا ، حددت شاشة التعبير الجهازية التي تقارن منظمات النسخ في أدمغة الأسماك المصابة بالآفات مقابل أدمغة النوع البري عددا من العوامل التي يتم التعبير عنها في السيفالون عن بعد والتي يتم تنظيمها استجابة للإصابة. يمكن أن تساعد طريقة الجرح التدريجي جنبا إلى جنب ، على سبيل المثال ، مع التسلسل العميق للحمض النووي الريبي أو التهجين في الموقع ، في تحديد الجينات الجديدة المشاركة في تكوين الخلايا العصبية للبالغين في أسماك الزرد وتجديدها وإصلاحها.