النمذجة الخلايا النجمية إمراض في المختبر و في فيفو استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء نماذج ورم نجمي معدلة وراثيا من أنواع الخلايا المحددة لتوصيف النمط الظاهري في المختبر وفي الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الخلايا الأولية من النوع البري من الفئران غير الكري التي تعبر عن الفئران المعدلة وراثيا المشروطة لحديثي الولادة للزراعة المختبرية. في الخطوة الثانية ، تصاب الخلايا الأولية بناقل غدي يشفر إعادة تركيب Cree للحث على إعادة التركيب الجيني لأليلات F flox في المختبر.

بعد ذلك ، يتم زراعة الخلايا المعاد تجميعها بشكل متسلسل لتوصيفها الظاهري. في النهاية ، يتم تحديد ما إذا كانت الطفرات المحددة تعزز عدم التخلق الدبقي في أنواع معينة من الخلايا العصبية من خلال توصيف الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالورم في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة الأورام العصبية الرئيسية مثل ما هي العواقب المظهرية للطفرات المرتبطة بالورم النجمي؟

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تطوير الأدوية قبل السريرية للأورام النجمية ، لأنه يمكن استخدام هذه الخلايا المحددة وراثيا في المختبر وفي الجسم الحي ، في الفئران التركيبية المؤهلة المناعة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات حصاد الخلايا وحقن تقويم العظام صعبة من الناحية الفنية وتتطلب تحديدا دقيقا للهياكل التشريحية. سيعرض الإجراء ريان باش ، فني من مختبري لحصاد أنسجة المخ.

ابدأ باستخدام مقص تشريح معقم بالإيثانول لعمل قطع سهمي في الجلد فوق جمجمة فأر حديثي الولادة القتل الرحيم البالغ من العمر من يوم إلى ثلاثة أيام ، وهو فأر معدل وراثيا من الحبل الشوكي إلى الأنف. بعد ذلك ، قم بعمل قطع في الجمجمة على طول الخيط السهمي ، بدءا من الحبل الشوكي ويمتد إلى ما بعد البصيلات الشمية. ثم استخدم ملقطا منحنيا لتقشير كل نصف كرة من الجمجمة برفق بشكل جانبي بعيدا عن الدماغ باستخدام ملقط دقيق مستقيم.

بعد ذلك ، قم بقرص الجزء الظهري من كل نصف كرة قشري برفق مع الحرص على تجنب المخيخ والبصلة الشمية ووضع أنسجة المخ في طبق زراعة الأنسجة يحتوي على H-B-S-S-N. تحت مجهر تشريح ، استخدم زوجين من الملقط الدقيق لإزالة السحايا برفق من كل نصف كرة قشري ووضع طبق زراعة الأنسجة مرة أخرى على الجليد لتجانس أنسجة المخ. أولا ، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لتقطيع نصفي الكرة القشرية أخيرا.

ثم انقل اللوحة إلى غطاء مزرعة الأنسجة وانقل قطع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلترا. اشطف الطبق بملليلتر واحد من HBSS المثلج وانقل الغسيل إلى الأنبوب أيضا. بعد إزالة HBSS الزائد عند ملليلترين من درجة حرارة الغرفة ، قم بربط شظايا الأنسجة بالأنبوب وربط شظايا الأنسجة بشكل أكبر عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات بماصة سعة مليلتر واحد.

احتضان معلق الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. خلط محلول الخلية بعناية عن طريق الانعكاس كل خمس دقائق بعد الحضانة ، قم بخلط ثلاثة ملليلتر من الوسائط الكاملة في تعليق الخلية لتثبيط التربسين عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات كما هو موضح للتو. ثم قم بتدوير الخلايا النجمية المنفصلة.

قم بإزالة snat بعناية باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد وأعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من 37 درجة مئوية. وسائط كاملة. ثم انقل تعليق الخلايا النجمية إلى قارورة ثقافة الأنسجة العلوية T 75 ، وحافظ على الخلايا النجمية القشرية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد حوالي 16 ساعة من الحصاد.

اغسل القارورة بأربعة ملليلتر من 37 درجة مئوية HBSS. ثم أضف أربعة ملليلتر من الوسائط الكاملة وحافظ على الخلايا النجمية القشرية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تصل المزرعة إلى حوالي 95٪ من التقاء ، قم بهز المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

ثم قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على الخلايا المنفصلة واغسل اللوحة بأربعة ملليلتر أخرى من 37 درجة مئوية HBSS. ثم أضف أربعة ملليلتر من الوسائط الكاملة الطازجة واحتضان الخلايا مرة أخرى بعد 24 ساعة من إثراء الثقافة للخلايا النجمية القشرية. قم بتحديث الثقافة بملليلترين من الوسائط الكاملة.

ثم احتضان الخلايا بملليلتر واحد من الوسائط الكاملة التي تحتوي على ميكرولتر واحد على الأقل في 10 من 10 من pfu العاشرة لكل مليلتر من الفيروس الغدي المعني عند 32 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند خمسة. تسبب عدوى Gfab CRE ميزة تكاثرية في الخلايا النجمية gfab المعاد تجميعها مما يزيد من نقاء الخلايا النجمية من 59٪ إلى أكثر من 90٪ بعد خمسة إلى تسعة مقاطع في الثقافة. بعد ست ساعات ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على الفيروس وأعد احتضان الثقافة في وسائط جديدة وكاملة.

بعد حصاد الخلايا النجمية القشرية عند حوالي 90٪ من التقاء ويتم تعليق عدد الخلايا المناسب في الجليد البارد 5٪ ميثيل السليلوز. ضع حقنة زجاجية سعة 250 ميكرولتر في موزع مستضد متكرر ، ثم قم بتوصيل إبرة غير حادة عيار 18 بالمحقنة. استخدم إبرة قياس 18 لشفط الخلايا النجمية القشرية في المحقنة وإزالة أي فقاعات هواء.

ثم تخلص من الإبرة قياس 18 وقم بتركيب إبرة قياس 27 على المحقنة. اضغط على الزر الموجود على موزع المستضد حتى يتم طرد السائل من الإبرة الجديدة لزرع الخلايا النجمية. بعد ذلك ، قم بتأمين متلقي ذو كفاءة مناعية يبلغ من العمر ثلاثة إلى ستة أشهر داخل إطار تجسيمي وقم بعمل شق فوق الخيط السهمي بطول 0.5 سم تقريبا بين الأذنين والعينين.

حدد موقع تقاطع الغرز الإكليلية والسهمية أو BRE MA ، وكذلك تقاطع لامدويد في الغرز السهمية أو لامدا. بعد التأكد من أن BMA و lambda في نفس المستوى الأفقي ، قم بتوصيل المحقنة وموزع المستضد المتكرر بالإطار التجسيمي فوق رأس ، ولجعل طرف الإبرة ملامسة bgma. ارفع الإبرة قليلا عن سطح الجمجمة وحرك ملليمترين جانبيا ومليمتر واحد منقاري من bgma.

ثم اخفض الإبرة بعناية من خلال الجمجمة إلى وجهتها. أربعة ملليمترات بطنية من بريج MA وتنشيط موزع المستضد المتكرر. مرة واحدة لحقن خمسة ميكرولتر من تعليق الخلية.

اترك الإبرة في مكانها لمدة دقيقتين للسماح للضغط داخل الجمجمة بالتوازن ثم اسحب الإبرة ببطء على مدى 30 ثانية باستخدام مقايضة قطنية للضغط على أي نزيف قد يحدث. أخيرا ، استخدم لاصق المناديل لتقريب حواف الجرح وإغلاق الشق ، ثم ضع في قفص نظيف ودافئ للتعافي. تتطلب الطعوم الغريبة لخطوط الخلايا البشرية الراسخة مضيفين يعانون من نقص المناعة وبشكل عام عدم تلخيص التشريح المرضي للأورام النجمية البشرية.

على سبيل المثال ، تشكل الطعوم الغريبة تقويم العظام U 87 MG أورام مقيدة لا تغزو الدماغ الطبيعي. في المقابل ، فإن حقن الخلايا النجمية الفارغة T RRP في أدمغة الفئران الزابكة المناعية ينتج عنها أورام تلخص السمات النسيجية لنظرائها من البشر ، ولا سيما غزو أنسجة المخ الطبيعية. لمراقبة نمو الطعم الخيفي الفارغ TRP ، تم التضحية بالفئران كل خمسة أيام بعد حقن الخلية ، وتم تحديد عبء الورم عن طريق تحديد منطقة الورم على أقسام الدماغ الملطخة h و e.

تم تحديد منطقة الورم لتزداد بشكل كبير بمرور الوقت ، وأدى الحقن التقويمي لمرة واحدة في 10 إلى خمس الخلايا النجمية TP nll في الأدمغة المتلقية إلى مراضة عصبية. بمتوسط بقاء على قيد الحياة 22 يوما. تم استخدام التصوير الطولي في الجسم الحي لتحديد حركية نمو الورم.

لذلك ، في هذه التجربة ، تم حقن الخلايا النجمية العقابية TR والمصممة للتعبير عن لوسيفيراز في أدمغة التركيب المناعي المختص. تم تحديد رفقاء القمامة ونمو الورم عن طريق التصوير التسلسلي للتلألؤ البيولوجي. لوحظت زيادة بمقدار 15 ضعفا في التلألؤ البيولوجي على مدى 16 يوما.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء اختبار المخدرات في المختبر وفي الجسم الحي لتحديد الفعالية واختبار تركيبات الأدوية الجديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حصاد الخلايا النجمية القشرية من الفئران غير المعدلة وراثيا المشروطة ، وكيفية تحفيز إعادة التركيب الجيني في المختبر ، وكيفية نمذجة تكوين الورم باستخدام الطعوم الخيفية في الفئران المؤهلة المناعة.