تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو استجواب RIC HIV للبروتينات السكرية ذات الغلاف الواحد أو تأكيد ENV بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول تعبيثات خلايا الالتصاق للتعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية الخيمري واحد بروتينات E NV على سطح الخلية. كخطوة ثانية ، يتم تحضين الخلايا بأجسام مضادة أحادية النسيلة مضادة ل ENV ، والتي ستربط ENV اعتمادا على التعرض للحاتمة.

بعد ذلك ، تتم إضافة جسم مضاد ثانوي مترافق HRP من أجل تحديد تفاعل الأجسام المضادة عن طريق فحص التلألؤ الكيميائي. تم الحصول على النتائج التي تظهر مستويات نسبية من الأجسام المضادة المرتبطة ب VNV بناء على وحدات الضوء النسبية المكتسبة لكل منها. حسنا ، الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الربط القائم على الحقائق ، هي أنه يمكن إجراء هذه التقنية بكمية منخفضة من الأجسام المضادة وبإنتاجية عالية ، سيقوم باحث ما بعد الدكتوراه في المختبر بإجراء هذه التقنية.

تستخدم خلايا الساركوما العظمية البشرية في هذه التجربة قبل يوم واحد من لوحة التعدي ، مرتين 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. في لوحة ثقافة خلية 96 بئر غير شفافة مناسبة لقراءة التلألؤ. يستخدم وسط النسر المعدل من delcos المكمل بمصل الأبقار الجنينية والبنسلين ستربتومايسين يحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي.

تحضير خليط التعداد. أولا ، ضع أنبوبين ، خليجان واثنين من B إلى خليجين. أضف خمسة ميكرولترات من DMEM مكملة ب 25 مللي مولار من الهيبيز ، متبوعا ب 10 نانوغرامات من بلازميد الطلاء والطلاء ، و 150 نانوغراما من فيروس نقص المناعة البشرية الخيمري بمغلف واحد من البروتين السكري المشفر للبلازميد.

لاحظ أن بلازميد ترميز TAT مطلوب فقط عند استخدام فيروس نقص المناعة البشرية المعتمد على مادة التهاب الكوز (TAT) ، وهو مغلف واحد من البروتين السكري ، ويقوم بتريز البلازميد إلى اثنين B عند خمسة ميكرولتر من DMM و 450 نانوغرام من البولي إيثارلين أو PEI. يجب تعديل كميات الكواشف والحمض النووي وفقا لعدد الآبار التي سيتم نقلها بنفس البروتين السكري لفيروس نقص المناعة البشرية. بعد ذلك ، أضف محتويات اثنين من B إلى خليجين واخلطهم جيدا عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان.

احتضان مزيج التعداء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد 10 دقائق ، أضف 10 ميكرولترات من مزيج التعداء لكل بئر من 96 لوحة بئر تحتضن لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ أكسيد الكربون. يتم إجراء Ali SA لدراسة التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية الخيمري بطبقة واحدة من البروتين السكري بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بعد يومين من تعدي خلايا الساركوما العظمية البشرية.

تحضير 250 مل من مخزن الغسيل لكل طبق يتم استخدامه في نفس الوقت. قم بإعداد 125 مل من المخزن المؤقت للحجب لكل طبق عن طريق إضافة 1٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم وخمسة ملليمولار من tris pH 8.0 إلى مخزن الغسيل. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا ومزيج التعداء من لوحة البئر 96.

أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لكل بئر واحتضنه لمدة 20 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد لكل بئر مخفف إلى التركيز المناسب في المخزن المؤقت للحظر. احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب ثم كرر عملية الغسيل ثلاث مرات. اغسل ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسداد ثم اغسله ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل بعد الغسيل الأخير. قم بإزالة السات.

أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب واحتضنه لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي المخفف من واحد إلى 3000 في المخزن المؤقت المانع. احتضن لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد 40 دقيقة.

اغسل ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب ، متبوعا بثلاث غسلات مع 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. لتحضير العينات للحصول على البيانات ، قم بإزالة المادة الطافية من لوحة البئر 96 وأضف 30 ميكرولترا من ركيزة تلألؤ كيميائي محسنة لكل بئر. احصل على إشارة تلألؤ كيميائي لمدة ثانية واحدة لكل بئر على قارئ لوحة مناسب.

وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، فإن تأثير القرص المضغوط القابل للذوبان أربعة أو S CD أربعة على تعرض الأقراص المضغوط أربعة I حواتم على البروتينات السكرية المغلفة أو ENV كان تفاعل الفحص للقرص المضغوط الرابع مع ENV يحفز التغييرات التأكيدية ENV التي تعرض 17 B و 48 D حواتم تتداخل مع موقع ربط المستقبلات المشتركة ، ولكنها لا تؤثر على المجال الخارجي للتعرف على الجسم المضاد Two G 12. لتقييم تأثير الطفرات النقطية في تأكيد NV ، تم استخدام اثنين من طفرات ENV H 66 A ، والتي لديها ميل منخفض لأخذ عينات تلقائية من التأكيد الرباعي المرتبط بالقرص المضغوط و S3 75 W ، مما يهيئ NV للحالة المضغوطة الأربعة المقيدة. يكشف تطبيع البيانات الأولية وفقا لمستويات التعبير أن H 66 A يقلل من التعرف على CD four I 17 B ، بينما يعزز S3 75 W إشارة 17 B وهو كاف لاستعادة النمط الظاهري ل H 66.

يتم نقل خلايا الفحص الطافرة بكميات متزايدة من قرص مضغوط أربعة مفسر. جنبا إلى جنب مع الأشرطة الزرقاء NV كشفت عن إشارات متزايدة للأجسام المضادة أحادية النسيلة CD four I ، A ثلاثة ، اثنان ، و C 11 ، والتي تعرفت على الحلقات المتقطعة في المجال الداخلي للبروتين السكري ENV. لم يتأثر التعرف على GP one 20 ENV بواسطة الجسمين المضادين G 12.

أخيرا ، تم تطبيع البيانات الأولية إلى اثنين من G 12 ، وغياب تعديل 32 و C 11 عندما تم نقل ENV باستخدام قرص مضغوط أربعة متحولة مع انخفاض القدرة على التفاعل مع ENV يشير إلى أن الإشارات المتزايدة تعتمد على تفاعل E NV CD أربعة بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات.