تحديد الهياكل الجزيئية لفيروس نقص المناعة البشرية جليكوبروتينات مغلف باستخدام البرد الكترون والتصوير المقطعي الآلي متوسط ​​الفرعية صورة مقطعية

أصيب أكثر من 60 مليون شخص بفيروس نقص المناعة البشرية ، وهو الفيروس المسبب للإيدز. إن فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز أزمة صحية عالمية، وعلى الرغم من أن الجهود البحثية المكثفة قد منحتهم حياة الأفراد المصابين بشكل كبير، إلا أن اللقاح الحقيقي لا يزال بعيد المنال. ينصب التركيز الرئيسي لأبحاث لقاح فيروس نقص المناعة البشرية على البروتين السكري ، الذي يستخدمه فيروس نقص المناعة البشرية لدخول الخلايا المستهدفة.

في هذا الفيديو، نوضح كيف نحصل على هياكل هذا البروتين المهم باستخدام تقنية تصوير تسمى التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. بدءا من فيروس نقص المناعة البشرية المنقى ، نعرض خطوات في تحضير العينات المجمدة ، وخطوات تسجيل الصور المجهرية الإلكترونية من هذه العينات المجمدة وخطوات تحويل هذه الصور إلى نماذج هيكلية يمكن أن تكون مفيدة لتصميم لقاح الإيدز لفيروس نقص المناعة البشرية. أحد الجوانب الفريدة لما نقدمه في هذا الفيديو هو أن العمل سيتم عرضه من قبل أعضاء مختبرها الذين يمتدون عبر مجموعة واسعة من الأعمار من طلاب المدارس المتوسطة والثانوية إلى طلاب الكلية والدراسات العليا وصولا إلى زملاء ما بعد الدكتوراه وكبار العلماء.

يتم تحضير عينات الفيروسات المزججة المناسبة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد عن طريق نشر تعليق مائي للفيروسات عبر ثقوب صغيرة في فيلم كربوني مدعوم بشبكة نحاسية ، ثم تجميد الفيروسات بسرعة. الهدف من هذه الخطوة هو تحضير عينة مجمدة من الفيروسات السليمة التي تم التقاطها في حالة قريبة من الموطن. للبدء ، يتم وضع الشبكات داخل وحدة تفريغ توهج.

هذا الجهاز بتنظيف الشبكات عن طريق تعريضها للغاز المؤين. الآن بعد أن أصبحت الشبكات جاهزة للاستخدام ، يتم إعداد تعليق من الفيروسات الممزوجة بجزيئات الذهب الصغيرة. هذه الجسيمات ضرورية لجمع البيانات ومعالجتها.

بعد ذلك ، يتم وضع قطرة من تعليق الفيروس على شبكة البلازما التي تم تنظيفها حديثا. ثم يتم تحميل الشبكة في روبوت ، مما يؤدي إلى مسحها بورق الترشيح ، مما يقلل من السقوط إلى طبقة رقيقة من السائل. ثم تغرق العينة في الإيثان السائل ، الذي يجمد الفيروسات بسرعة بمعدل يتجاوز 100،000 كلفن في الثانية.

ثم يتم نقل الشبكة المجمدة إلى صندوق تخزين لنقلها إلى المجهر. يتكرر هذا حتى يتم تجميد العدد المطلوب من الشبكات. الآن بعد أن أصبحت شبكات عينات الفيروسات جاهزة ، فإن الخطوة التالية هي تحميلها في المجهر.

للتصوير ، يمكن القيام بذلك يدويا أو بمساعدة روبوتية. عندما يتم تحميل شبكات العينة يدويا ، يجلس المستخدم في محطة متخصصة حيث يمكن معالجة العينات تحت النيتروجين السائل ، ويتم وضع العينات في غرفة محمولة مبردة بالنيتروجين يتم إغلاقها وإخلاؤها ثم توصيلها بالمجهر. المجاهر الأحدث قادرة على تحميل عينات أكثر آلية.

هنا في مجهر Titan Cryos ، يتم تسليم العينات المجمدة إلى المجهر من قبل المستخدم ثم يتم تحميلها آليا بشبكات العينات المحملة في المجهر. يمكن للمستخدم فحص كل شبكة قبل بدء التصوير. يتم إعداد معلمات المجهر لكل منطقة على شبكة العينة التي تحتوي على ميزات ذات أهمية.

في هذه الحالة ، الميزات هي فيروسات فيروس نقص المناعة البشرية. عندما يتم تحديد كل منطقة جديدة ، يقوم كمبيوتر المجهر بتخزين معلمات التصوير الخاصة بالمنطقة. عندما يحدد المستخدم جميع المراكز ذات الاهتمام، يعيد الكمبيوتر النظر في كل مركز تلقائيا ويجمع مجموعة بيانات.

يتم جمع كل مجموعة بيانات عن طريق إمالة شبكة العينة فيما يتعلق بحزمة الإلكترون ، مع ضمان بقاء الحزمة مركزة في نفس المكان على الشبكة. يتطلب جمع البيانات في المجهر الإلكتروني تقليديا من المستخدمين الجلوس على المجهر والتفاعل جسديا مع المعدات. يظهر هذا النمط من تفاعل المجهر هنا خلال زيارة قام بها الرئيس أوباما إلى مصنع للاستخبارات.

وتتيح التطورات الحديثة في السطوح البينية الحاسوبية المجهرية الآن للمستخدمين رصد وضبط جمع البيانات في الوقت الفعلي من جهاز كمبيوتر بعيد في المختبر أو في أي مكان آخر. من أجل تصور أشكال الغلاف ، يجب حساب متوسط المعلومات من مئات الصور الفردية لتعزيز الإشارة. هذه عملية مكثفة من الناحية الحسابية ، والتي يتم إنجازها هنا باستخدام مجموعة من أجهزة الكمبيوتر تسمى Bio Wolf.

تقع في المعاهد الوطنية للصحة ، وقد تم تطوير طرق قوية لاستخراج الأحجام الفردية ومتوسط المعلومات باستخدام الخوارزميات التي يمكن أن تعمل بمستويات الضوضاء العالية. جوهرية في هذا النوع من البيانات ، توفر خرائط الكثافة التي تم الحصول عليها من كل من الفيروسات والفيروسات المحلية المعقدة إلى الجزيئات المهمة بيولوجيا قاعدة بيانات غنية بالمعلومات حول البيولوجيا الهيكلية لفيروس نقص المناعة البشرية. تنبض خرائط الكثافة بالحياة بالتفاصيل الجزيئية عندما يتم دمج البيانات مع معلومات من علم البلورات بالأشعة السينية للوحدات الفرعية الفردية التي تشكل ارتفاع البروتين السكري في الغلاف.

يمكن أن تكون البيانات التي تخرج من هذه القوالب كثيفة للغاية وصعبة interpret. 3D يمكن استخدام برامج صناعة الترفيه لتصور النماذج ثلاثية الأبعاد عن طريق إضافة الألوان والقوام والإضاءة ، مما يسهل تحليلها. يتضمن برنامج التصور شائع الاستخدام Mirror 3D Studio Max و Maya.

لقد أظهرنا للتو إجراءات خطوة بخطوة لكيفية الحصول على نماذج جزيئية لبنية الغلاف. البروتين السكري ، بدءا من فيروس نقص المناعة البشرية المنقى. باستخدام هذه الطريقة ، حددنا أيضا هياكل لبروتين السكر في الغلاف مع مجموعة متنوعة من الجزيئات التي يمكنها ربط الفيروس واستخدامه.

نعرض هنا مثالا على بنية البروتين السكري في الغلاف المركب مع جسم مضاد يسمى B12. إن فهم سبب قدرة بعض الجزيئات على ربط الفيروس واستخدامه بينما لا يرتبط البعض الآخر به أمر مهم جدا لتصميم اللقاح العقلاني. يعد تحديد الهياكل الجزيئية للبروتينات السكرية المغلفة من فيروس نقص المناعة البشرية أو من فيروسات أخرى ، مثل الأنفلونزا والإيبولا ، أمرا أساسيا لفهم دخول الفيروس واستخدامه.

كما رأيت ، يظهر التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد الآن كأداة قوية لتحقيق هذا الهدف.