تطوير في المختبر نظام نموذجي لدراسة تفاعل ايكوس الحصانية إيج مع مستقبلات لها عالية تقارب FcεRI

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس كمية إطلاق الوسيط المعتمد على IgE من خلايا ابيضاض الدم القاعدي RAD. تحدث أعراض الحساسية بسبب إطلاق وسطاء مثل الهيستامين. الآن ، الهيستامين ليس الوسيط الوحيد الذي تطلقه الخلايا القاعدية هي الخلايا البدينة.

ينتج عن إجمالي جميع الوسطاء الذين تطلقهم هذه الخلايا علامات وأعراض فرط الحساسية الفوري والمتأخر. الآن ، البشر ليسوا الكائنات الحية الوحيدة التي تعاني من حساسية والخيول أيضا. من أجل تطوير البحث بشكل أكبر وإيجاد علاجات ضد الحساسية مثل اللقاحات ، يلزم إجراء اختبار إطلاق لتحديد كمية الوسطاء الذين تم إطلاقهم ، إن وجدوا ، من العلاج البحثي.

هذا هو سبب اختبار الإصدار هذا. تم تطوير وسيط RBL الذي أصدره الاختبار للنظام البشري ونشره لأول مرة بواسطة Ian and Hook في عام 1986. تم تطويره لاحقا لنظام DOC والآن لنظام الخيول.

التعديلات بسيطة مثل تغيير البروتينات ذات الأهمية. كانت أخبار خط الخلية هي سرطان الدم في الفئران باسو أو RBL اثنين من خط الخلية H 3.1 الذي يعبر عن سلسلة ألفا لمستقبلات FNT ffc Serin R واحدة للخيول إلى كثافة خلية تبلغ 500،000 خلية لكل مليلتر. أضف الجسم المضاد IgE المعني إلى التركيز النهائي البالغ نانوجرام واحد لكل ملليلتر.

أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى صفيحة تربة 96 واحتضن لمدة 16 ساعة عند 37 درجة. هذا يسمح للخلايا بالالتصاق بسطح البئر ويرتبط الجسم المضاد بغسل مستقبلاته. ضعف الوسائط التي تحتوي على الجسم المضاد المتبقي غير المرتبط والخلايا الميتة مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ 37 درجة تطلق.

تخلص من المخزن المؤقت من آخر غسلة واستبدلها ب 100 ميكرولتر من المستضد المعني عند تركيز الاهتمام. بعد 20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة ، انقل 50 ميكرولترا من SUP natin الذي يحتوي على وسطاء الإطلاق إلى بئر جديد واستبدل المادة الطافية المتبقية ب 50 ميكرولتر من Triton X عازلة لتجميع الخلايا وإطلاق الوسطاء المتبقيين داخل الخلايا. عند 50 ميكرولتر من 2 مليون مولار بيتا hx.

عدة أيام الركيزة الذائبة في عازلة السترات. بعد حضانة لمدة ساعتين عند 37 درجة ، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت tris إلى كل بئر يحول البئر إلى اللون الأصفر. قم بقياس امتصاص اللون عند 405 نانومتر بعد 16 ساعة.

قم بتسخين المخزن المؤقت لمقايسة الإطلاق ، المعروف أيضا باسم Ian Buffer عند 37 درجة. قم أيضا بإعداد تدرج تركيز المستضد في المخزن المؤقت للإفراج بتركيزات. صفر 0.1 1 10 و 100 و 1000 و 10 ، 000 نانوجرام لكل مليلتر.

ثم يسخن عند 37 درجة. اغسل الآبار عن طريق تحريك الطبق بسرعة لإزالة الوسائط وإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ باتجاه جدران الآبار. هذا لتقليل إجهاد الخلية من اختلاف درجة الحرارة ، مما يجعلها تطلق الوسطاء قبل الأوان.

يجب غسل الطبق مرتين. تخلص من المخزن المؤقت للتحرير النهائي ، واغسل وأضف 100 ميكرولتر من المستضد ، بدءا من تركيز المستضد الصفري في الصف A للتحكم السلبي ، والنزول إلى أسفل تدرج التركيز من الصفوف B إلى G وأخيرا إلى شرائح Triton X ، قم بالتخزين المؤقت في الصف H. احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة.

هذه هي النقطة التي تطلق فيها الخلايا الوسطاء بعد فترة الحضانة. انقل 50 ميكرولترا من السائل في كل بئر إلى البئر الخاص به. في العمود من السابع إلى 12 ، قم بإخراج السائل المتبقي تماما والتخلص منه في المواضع من واحد إلى ستة واستبدله ب 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل Triton X.

أضف 50 ميكرولترا من الركيزة المحضرة إلى جميع بئر الطبق البالغ عددها 96 بئرا. احتضن عند 37 درجة لمدة ساعتين. يتحدث بيتا H ، عدة أيام ، الركيزة إلى أربعة نيترو فينول.

بعد فترة الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت tris ، وتحويل الفينول النيترو الأربعة إلى اللون الأصفر. اقرأ اللوحة باستخدام مقياس الطيف الضوئي للوحة عند 405 نانومتر. بعد قياس بيانات الامتصاص ، احسب الكمية الإجمالية للوسطاء داخل الخلايا في موضع الآبار A واحد بالضرب.

المقابلة لها جيدا في الموضع a سبعة في اثنين وإضافة النتيجة إلى القيمة عند واحد. هذا لأنه أثناء التجربة ، لدينا السوبينات التي تحتوي على معارضة وسطاء الإفراج A واحدة حيث قمنا بنقلها إلى معارضة بئر جديدة. سبعة.

كرر الحسابات لبقية الآبار. احسب النسبة المئوية لوسطاء الإطلاق في معارضة البئر ، A سبعة من إجمالي الوسطاء المحسوبين داخل الخلايا بضرب قيمة الموضع A سبعة في اثنين. مرة أخرى ، لأنه أثناء التجربة ، لدينا supernat الذي يحتوي على وسطاء Rees.

عندما نقلناه إلى منتج جديد ، اضرب هذا المنتج في 100 واقسم هذا المنتج على القيمة الإجمالية المقابلة للوسطاء داخل الخلايا لهذا الموضع. هذا يعطي النسبة المئوية لوسطاء الإصدار للانتفاخ. كرر الحسابات لبقية الآبار لأن الانتفاخات الستة في كل صف يتم تحديها بنفس تركيز متوسط المستضد.

ترسم هذه القيم وحساب الانحراف المعياري هذه القيم على الرسم البياني على النحو التالي. يوضح الرسم البياني أنه مع زيادة تركيز المستضد ، يتم إطلاق المزيد من الوسطاء حتى يصل إلى ذروته عند 100 نانوجرام لكل مليلتر ، وبعد ذلك ينخفض إطلاق الوسيط مع زيادة تركيز المستضد. يجب أن تبدو النتيجة التجريبية النهائية مثل هذه الرسوم البيانية كما يمكن رؤيتها في الرسم البياني B. لا تحتوي مقايسة إطلاق التحكم باللون الأزرق الفاتح على أجسام مضادة IgE وبالتالي لا تظهر أي تغيير في إطلاق الوسيط مع زيادة تركيز المستضد.

قارن هذا بالنتيجة التجريبية باللون الأزرق الداكن ، والتي يمكن أن تحتوي على جسم مضاد IgE. هذا مثال على لقاح مضاد للغاز المسال يتم اختباره للتأكد من سلامته. يتضح من هذا الرسم البياني باللون الأحمر أن المصل المضاد ل IgE يربط المستقبلات الموجودة على سطح الخلية مما يتسبب في إزالة حبيبات خلايا RBL تماما كما هو موضح في التحكم الإيجابي باللون الأرجواني مقارنة بالتحكم السلبي باللون الرمادي مما يجعل هذا اللقاح غير آمن.

هذا الاختبار مفيد للغاية لأنه يمكن أن يقيس إطلاق الوسيط ، أو تأخره عند اختبار الأدوية المضادة للحساسية المحتملة أو اللقاحات يمكن أيضا تكييفها مع أنظمة البشرية أو الخيول كما هو موضح ، يمكن للفحص تحديد الحظر الناجح أو المنع غير الناجح لإطلاق الوسيط عند اختبار الأجسام المضادة للحساسية.