التنمية والتحقق من طريقة PCR الكمي لEquid الفيروسة-2 التشخيص في الجهاز التنفسي السوائل

الهدف العام لطريقة qPCR هو تقييم الحمل الفيروسي لفيروس الهربس الخيولي -2 في العينات البيولوجية من الخيول. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجالات التشخيصية لأمراض الجهاز التنفسي في الخيول ، والبيانات الكمية حول الوسائل التفسيرية الجديدة للممارسين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة حساسة ومحددة وسريعة.

ميزة أخرى هي التطوير وفقا ل AFNOR norme NF U47-600 ، وهو الممثل الفرنسي في لجنة التطبيع الدولية. ستظهر الإجراء إريكا هيو ، باحثة شابة من وحدتي. لاستخراج الأحماض النووية من عينة بيولوجية من سوائل الجهاز التنفسي ، تحت غطاء الدخان ، ابدأ بإضافة 140 ميكرولترا من العينة البيولوجية إلى 560 ميكرولتر من محلول التحلل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

أضف 560 ميكرولترا من الإيثانول إلى العينة ، وقم بتطبيق 630 ميكرولترا من المحلول الكلي على عمود السيليكا وأجهزة الطرد المركزي. ضع 630 ميكرولترا المتبقية على عمود السيليكا وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد تطبيق العينة على العمود ، استخدم 500 ميكرولتر لكل من مخازن الغسيل AW1 و AW2 لغسل العمود مرتين.

ثم لتصفية الأحماض النووية من العمود ، أضف 50 ميكرولترا من شطف درجة حرارة الغرفة أو المخزن المؤقت AVE. أغلق الغطاء واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ثم جهاز الطرد المركزي عند 6 ، 000 غرام لمدة دقيقة واحدة.

لتضخيم الحمض النووي ، بعد معايرة البادئات والمسبار وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد 22.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل لكل تفاعل عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي ، و 20 ميكرومولار أولي للأمام والعكسي ، و 10 ميكرومولار من المسبار ، وما يكفي من الماء فائق النقاء كما هو مطلوب للوصول إلى 22.5 ميكرولتر. لتجنب التلوث ، قم دائما بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في منطقة معينة. Aliquot 22.5 ميكرولتر من مزيج التفاعل المناسب لكل تفاعل بئر من 96 بئر.

قم بتضمين عناصر تحكم سلبية للاستخراج و PCR لضمان عدم تلوث أي من الكواشف بالحمض النووي غير المرغوب فيه. بعد ذلك ، أضف 2.5 ميكرولتر من العينة ، أو التحكم السلبي في الاستخراج ، أو التحكم السلبي PCR ، أو عينة التحكم الإيجابية إلى آبار التفاعل المقابلة. ثم استخدم ختم لوحة لاصقة لتغطية اللوحة.

وجهاز طرد مركزي عند 6 ، 000 جم لمدة 10 ثوان. ضع اللوحة في نظام PCR في الوقت الفعلي. ثم حدد قالب تخطيط الفحص وإعدادات برنامج PCR الموضحة هنا، وابدأ التشغيل.

بعد نقل البيانات الأولية من نظام PCR في الوقت الفعلي إلى جدول بيانات ، قم بتعيين العتبة في مخططات التضخيم فوق خط الأساس وداخل منطقة النمو الأسي للحصول على دورة العتبة لكل عينة. ارسم كل معيار نقطة تم تعيينه كمنحنى قياسي للحصول على الخطية. ثم احسب رقم النسخة للعينات المختلفة بناء على المنحنى القياسي.

لتحديد حد الكشف عن نتائج qRT-PCR ، قم بتوزيع 90 ميكرولترا من الماء فائق النقاء في ستة أنابيب. لتحضير ستة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من البلازميد لاستهداف منطقة التخفيف ، ابدأ بنقل 10 ميكرولتر من تخفيف عمل البلازميد إلى الأنبوب مع 90 ميكرولتر من الماء فائق النقاء. لفترة وجيزة دوامة والطرد المركزي الأنبوب.

ثم انقل 10 ميكرولتر من الأنبوب إلى أنبوب الماء التالي. بعد الدوامة والطرد المركزي ، كرر النقل حتى تتلقى جميع أنابيب الماء البلازميد. بعد تضخيم الحمض النووي في التخفيفات التسلسلية الستة عشرة أضعاف كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، حدد منطقة التخفيف ، وهي آخر تخفيف للبلازميد ينتج إشارة موجبة والتخفيف الأول دون الكشف.

لتحضير ستة تخفيفات تسلسلية مزدوجة ، قم بتوزيع 25 ميكرولترا من الماء فائق النقاء في ستة أنابيب. من التخفيف الأخير للبلازميد الذي أعطى إشارة إيجابية من التخفيفات عشرة أضعاف ، قم بنقل 25 ميكرولتر من الأنبوب إلى الأنبوب الأول من الماء. الدوامة وأجهزة الطرد المركزي قبل تحضير التخفيفات الخمسة المتبقية كما هو موضح للتو.

تضخيم الحمض النووي من التخفيفات التسلسلية المزدوجة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. بعد تضخيم الحمض النووي من التجارب الثلاث المستقلة ، احسب عدد التكرارات الإيجابية من أصل 24 تكرارا لكل مستوى من تركيز البلازميد. حدد LOD بثقة 95 بالمائة أو LOD 95 بالمائة PCR، وهو المستوى الذي ينتج عنه اكتشاف 23 تكرارا موجبا من أصل 24 تكرارا.

لتحديد LOD للطريقة قم بإعداد خمسة تخفيفات تسلسلية مزدوجة تبدأ ب 25 ميكرولترا من تخفيف عمل البلازميد الذي يكون أكثر تركيزا بأربع مرات من التركيز الأخير من التخفيف بمقدار عشرة أضعاف الذي أعطى إشارة موجبة. يأتي البلازميد المستخدم في خطوة التضخيم من تخفيف عمل البلازميد المحضر في منطقة معينة لتجنب التلوث. إنها خطوة حاسمة.

انقل 5 ميكرولتر من كل تخفيف من البلازميد إلى أربعة أنابيب مع 135 ميكرولتر من مادة الموارد السلبية للحصول على أربع نسخ مكررة من المعايير الإيجابية الخمسة. قم باستخراج التكرارات الأربعة للمعايير الإيجابية الخمسة وقم بإجراء التضخيم كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. احسب عدد التكرارات الموجبة من أصل ثمانية تكرارات لكل مستوى من تركيز البلازميد.

أخيرا ، حدد طريقة LOD ، وهي المستوى الأخير الذي تكون فيه ثمانية مكررات من أصل ثمانية مكررات موجبة. تكتشف طريقة RT-PCR الكمية الموضحة في هذا الفيديو فيروس الهربس -2 في سوائل الجهاز التنفسي وتحددها. في هذه التجربة ، تم إجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لتقدير منطقة التخفيف ، والتي تقع بين التخفيفات من 10 إلى سالب 9 و 10 إلى سالب 10.

تم تحديد قيمة LOD PCR من خلال تخفيف تسلسلي مزدوج جديد في منطقة التخفيض. لتحديد نطاق الخطية و LOQ PCR تم استخدام قيمة LOD PCR لبدء نطاق ستة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف بين 2.6 ، قيمة LOD PCR ، و 260،000 نسخة لكل 2.5 ميكرولتر من العينة. LOQ PCR هو أدنى تركيز في النطاق الخطي.

توصيف الطريقة بأكملها هو التحقق من صحة جميع الخطوات اللازمة للحصول على بيانات qRT-PCR من استخراج الحمض النووي من عينة الجهاز التنفسي ، إلى تضخيم الهدف وقياسه الكمي. تم تقييم الأداء الكمي للطريقة التحليلية الكاملة qRT-PCR والتحقق من صحتها باستخدام ملف تعريف الدقة الممثل في هذا الرسم البياني. يتم تحميل الجينوم الفيروسي EHV2 في 172 عينة من مسحة الأنف من الخيول المصابة باضطرابات الجهاز التنفسي حيث يتم تحديدها كميا كما هو موضح هنا.

كانت أحمال الجينوم الفيروسي أعلى في الخيول الصغيرة ، حيث تم اكتشاف أعلى حمل عند 1.9 مرة من 10 إلى 11 نسخة لكل مليلتر. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين لكل خطوة تضخيم ، ويمكن تنفيذ إجمالي خطوات التحقق في أقل من أربعة أسابيع إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب خطر التلوث ، خاصة عند العمل بمحلول البلازميد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التسلسل من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الجينوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء استخراج وتضخيم الحمض النووي وتوصيف احتياطيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة بهم. لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية مثل مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب دائما اتخاذ بعض الاحتياطات مثل العمل في غطاء محرك السيارة ومنطقة مستوى الأمان الملائمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.