التنمية والتحقق من طريقة PCR الكمي لEquid الفيروسة-2 التشخيص في الجهاز التنفسي السوائل

الهدف العام من طريقة qPCR هو تقييم الحمل الفيروسي لفيروس الهربس الخيلي من النوع الثاني (equine herpesvirus-2) في العينات البيولوجية المأخوذة من الخيول. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجالات التشخيصية للأمراض التنفسية في الخيول، وتوفير بيانات كمية كأدوات تفسيرية جديدة للممارسين. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة حساسة ونوعية وسريعة.

وميزة أخرى هي التطوير وفقاً لمعيار AFNOR norme NF U47-600، وهو الممثل الفرنسي في اللجنة الدولية للتقييس. ستقوم إيريكا هو، وهي باحثة شابة من وحدتي، بشرح الإجراء. لاستخلاص الأحماض النووية من عينة بيولوجية من السوائل التنفسية، ابدأ تحت خزانة استخلاص الأبخرة بإضافة 140 µL من العينة البيولوجية إلى 560 µL من محلول التحلل، ثم حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

أضف 560 µL من الإيثانول إلى العينة، ثم ضع 630 µL من إجمالي المحلول على عمود السيليكا وقم بالطرد المركزي. ضع الـ 630 µL المتبقية على عمود السيليكا وقم بالطرد المركزي مرة أخرى. بعد وضع العينة على العمود، استخدم 500 µL من كل من محاليل الغسيل AW1 و AW2 لغسل العمود مرتين.

ثم لاستخلاص الأحماض النووية من العمود، أضف 50 µL من محلول الاستخلاص أو Buffer AVE في درجة حرارة الغرفة. أغلق الغطاء واتركه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي بسرعة 6,000 ×g لمدة دقيقة واحدة.

لتضخيم الحمض النووي DNA، وبعد معايرة البادئات والمسبار وفقاً لبروتوكول النص، يتم تحضير 22.5 µL من مزيج التفاعل لكل تفاعل عن طريق إضافة 12.5 µL من المزيج الرئيسي لبادئ PCR، وبادئات أمامية وعكسية بتركيز 20 µM، ومسبار بتركيز 10 µM، وكمية كافية من الماء فائق النقاء حسب الحاجة للوصول إلى 22.5 µL. ولتجنب التلوث، يجب دائماً تحضير مزيج تفاعل PCR في منطقة مخصصة. يتم توزيع 22.5 µL من مزيج التفاعل المناسب على كل بئر تفاعل في لوحة ذات 96 بئراً.

قم بتضمين ضوابط سلبية لعمليتي الاستخلاص وPCR للتأكد من عدم تلوث أي من الكواشف بحمض DNA غير مرغوب فيه. بعد ذلك، أضف 2.5 µL من العينة، أو ضابط الاستخلاص السلبي، أو ضابط PCR السلبي، أو عينة الضابط الإيجابي إلى آبار التفاعل المقابلة. ثم استخدم غطاءً لاصقاً للأطباق لتغطية الطبق.

ثم قم بالطرد المركزي عند 6,000 gs لمدة 10 ثوانٍ. ضع اللوحة في نظام PCR في الوقت الحقيقي. بعد ذلك، اختر القالب الخاص بتخطيط المقايسة وإعدادات برنامج PCR الموضحة هنا، وابدأ عملية التشغيل.

بعد نقل البيانات الخام من نظام PCR في الوقت الحقيقي إلى جدول بيانات، حدد عتبة الكشف في مخططات التضخيم بحيث تكون أعلى من خط الأساس وضمن منطقة النمو الأسي للحصول على دورة العتبة لكل عينة. ارسم كل نقطة من مجموعة المعايير كمنحنى قياسي للحصول على الخطية. ثم احسب عدد النسخ للعينات المختلفة بناءً على المنحنى القياسي.

لتحديد حد الكشف لنتائج qRT-PCR، وزع 90 µL من الماء فائق النقاء في ستة أنابيب. ولتحضير ستة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من البلازميد لاستهداف منطقة التناقص، ابدأ بنقل 10 µL من تخفيف البلازميد العامل إلى الأنبوب الذي يحتوي على 90 µL من الماء فائق النقاء. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز vortex لفترة وجيزة ثم قم بطرد مركزي للأنبوب.

ثم انقل 10 µL من الأنبوب إلى أنبوب الماء التالي. بعد الرج بمجهاز الفورتيكس والطرد المركزي، كرر عملية النقل حتى تستقبل جميع أنابيب الماء البلازميد. بعد تضخيم DNA في التخفيفات التسلسلية العشرية الستة كما تم وصفه سابقاً في هذا الفيديو، حدد منطقة التلاشي، وهي آخر تخفيف للبلازميد يعطي إشارة إيجابية وأول تخفيف لا يتم فيه الكشف.

لتحضير ست تخفيفات تسلسلية بمقدار ضعفين، يتم توزيع 25 µL من الماء عالي النقاء في ستة أنابيب. من آخر تخفيف للبلازميد الذي أعطى إشارة إيجابية في التخفيفات العشرية، يتم نقل 25 µL من الأنبوب إلى أول أنبوب يحتوي على الماء. يُرج المزيج بجهاز الفورتكس ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي قبل تحضير التخفيفات الخمسة المتبقية كما تم توضيحه.

قم بتضخيم الحمض النووي DNA من التخفيفات التسلسلية المضاعفة كما تم وصفه سابقاً في هذا الفيديو. وبعد تضخيم الحمض النووي DNA من التجارب الثلاث المستقلة، احسب عدد المكررات الإيجابية من أصل 24 مكرراً لكل مستوى من تركيز البلازميد. حدد حد الكشف LOD بثقة 95% أو LOD 95% PCR، وهو المستوى الذي يؤدي إلى الكشف عن 23 مكرراً إيجابياً من أصل 24 مكرراً.

لتحديد حد الكشف (LOD) للطريقة، قم بتحضير خمسة تخفيفات تسلسلية بمعدل تضاعف ثنائي، بدءاً من 25 µL من تخفيف عمل البلازميد الذي يكون تركيزه أكبر بأربع مرات من التركيز الأخير من تخفيف عشري أعطى إشارة إيجابية. يتم الحصول على البلازميد المستخدم في خطوة التضخيم من تخفيف عمل للبلازميد تم تحضيره في منطقة محددة لتجنب التلوث؛ وهي خطوة حرجة.

انقل 5 µL من كل تخفيف للبلازميد إلى أربعة أنابيب تحتوي على 135 µL من المادة المرجعية السلبية للحصول على أربع مكررات للمعايير الإيجابية الخمسة. قم بإجراء عملية الاستخلاص للمكررات الأربعة للمعايير الإيجابية الخمسة ونفذ إجراء التضخيم كما تم وصفه سابقًا في هذا الفيديو. قم بحساب عدد المكررات الإيجابية من أصل ثمانية مكررات لكل مستوى من تركيز البلازميد.

أخيراً، يتم تحديد طريقة حد الكشف (LOD)، وهو المستوى الأخير الذي تكون عنده ثماني مكررات من أصل ثماني مكررات إيجابية. تكتشف طريقة RT-PCR الكمية الموضحة في هذا الفيديو فيروس الهربس الخيلي-2 وتحدده كمياً في السوائل التنفسية. في هذه التجربة، تم إجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لتقدير منطقة التضاؤل، والتي تقع بين التخفيفات 10⁻⁹ و 10⁻¹⁰.

تم تحديد قيمة حد الكشف (LOD) لتقنية PCR من خلال إجراء تخفيف تسلسلي جديد بنسبة الضعف في منطقة التخفيف. ولتحديد نطاق الخطية وحد التقدير الكمي (LOQ) لتقنية PCR، استُخدمت قيمة LOD PCR كنقطة بداية لنطاق مكون من ستة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف، تتراوح بين 2.6، وهي قيمة LOD PCR، و260,000 نسخة لكل 2.5 µL من العينة. ويعد LOQ PCR أدنى تركيز ضمن نطاق الخطية.

يتمثل توصيف الطريقة بأكملها في التحقق من صحة جميع الخطوات اللازمة للحصول على بيانات qRT-PCR، بدءاً من استخلاص DNA من العينة التنفسية، وصولاً إلى تضخيم الهدف وقياس كميته. وقد تم تقييم والتحقق من صحة الأداء الكمي للطريقة التحليلية الكاملة لـ qRT-PCR من خلال ملف دقة ممثل في هذا الرسم البياني. كما تم قياس حمولات الجينوم الفيروسي لـ EHV2 في 172 عينة من مسحات أنفية لخيول تعاني من اضطرابات تنفسية كما هو موضح هنا.

كانت أحمال الجينوم الفيروسي أعلى في الخيول الصغيرة، حيث تم اكتشاف أعلى حمل بنسبة 1.9 × 10¹¹ نسخة لكل ملليلتر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في أقل من ساعتين لكل خطوة تضخيم، ويمكن تنفيذ إجمالي خطوات التحقق في أقل من أربعة أسابيع إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب مخاطر التلوث، خاصة عند التعامل مع محلول البلازميد.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التسلسل الجيني للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الهوية الجينومية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء استخلاص وتضخيم DNA وتوصيف نواتج PCR الخاصة بها. لا تنسَ أن العمل مع العينات البيولوجية مثل الممرضات قد يكون خطيراً للغاية.

يجب دائمًا اتخاذ بعض الاحتياطات عند تنفيذ هذا الإجراء، مثل العمل داخل خزانة استخلاص من الأدخنة (hood)، وفي منطقة ذات مستوى أمان مُهيأ.