المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مكتبات تسلسل لدقة زوج القاعدة D-N-A-C-P-G ، تحليل المثيلة على أساس هضم إنزيم التقييد جنبا إلى جنب مع السيتوزين عن طريق تحويل الكبريتيت. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء أول ملخص إنزيم تقييد واحد MSP للحمض النووي عالي الجودة ، متبوعا بالإصلاح النهائي ، ومخلفات وربط المحولات الميثيلية. الخطوة التالية هي إجراء تحويل الكبريتيت على حجم الأجزاء المحددة بعد تحويل الكبريتيت.

يتم تضخيم الشظايا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الخطوة الأخيرة هي إجراء مراقبة الجودة والتسلسل ، متبوعا بتصور البيانات وتحليلها. في النهاية ، يكتشف التمثيل المنخفض المعزز لتسلسل ثنائي الكبريتيت دقة زوج القاعدة الكمية لأنماط مثيلة السيتيدين في المواقع الجينومية الغنية ب CG.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق مثيلة الحمض النووي الأخرى ، مثل المصفوفات الدقيقة ، هي أنها يمكن أن تستخدم كميات صغيرة من مواد الإدخال لتوليد بيانات مثيلة D-N-A-C-P-G عالية التغطية بدقة زوج القاعدة والمواقع ذات الصلة بيولوجيا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا مهتمين باستكشاف الأنماط اللاجينية خارج المناطق التي تغطيها المقايسات التقليدية. كنا مهتمين بتطوير هذه التقنية للانتقال من المصفوفات الدقيقة إلى توليد بيانات مثيلة الحمض النووي بدقة الزوج الأساسي التي يمكن دمجها مع البيانات التي تم إنشاؤها من تقنيات الجيل التالي الأخرى.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق. على سبيل المثال ، الزخرفة اللاجينية وعدم التجانس في العينات البيولوجية مقارنة بالضوابط العادية أو الحالات المرضية الأخرى. بشكل عام ، سيجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة نظرا لطول الإجراء والمتطلبات المحددة العديدة وخصائص التسلسل الفريدة للمكتبات التي تم إنشاؤها لسقوط مامي.

سيساعد أخصائي أبحاث في مختبرنا في إظهار الإجراء لبدء هذا البروتوكول. أولا ، قم بإعداد حصص منقاة من عينات الحمض النووي الجينومية التي خضعت لملخص إنزيم تقييد واحد MSP ، وتفاعل إصلاح نهاية حادة ، وإضافة نيوكليوتيدات واحدة في النهايات الأولية الثلاثة. في هذه المرحلة ، ستكون منتجات الحمض النووي جاهزة لربط المحول لبدء نقل 10 ميكرولترات من عينة A-A-L-D-N-A إلى أنبوب PCR سعة 0.2 مليلتر ، ووضع الأنبوب على الجليد.

بالإضافة إلى ذلك ، ضع حصة من جزيئات المحول على الجليد. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج كاشف الربط على الثلج. أضف كل من كاشف الربط وجزيئات المحول إلى عينة الحمض النووي والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات للخلط.

ضع أنبوب PCR في جهاز تدوير حراري واترك تفاعل الربط يستمر طوال الليل عند 16 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بتنقية منتجات الربط باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي ذات الطور الصلب القائم على حبة مغناطيسية أو عمود السيليكا. في الخطوة الأخيرة من عملية التنقية.

قم بتخفيض الحمض النووي بإضافة 30 ميكرولترا من الماء الخالي من الحمض النووي. يمكن تخزين منتج الحمض النووي المنقى عند سالب 20 درجة مئوية حتى الحاجة إلى العينات ، والتي بدأت بإجمالي الحمض النووي البالغ 25 نانوغراما أو أكثر. استخدم جهاز استخراج هلام آلي مثل PI و Prep لاختيار المنتجات المربوطة بأطوال تتراوح بين 150 زوجا أساسيا و 400 زوج أساسي.

تأكد من استبعاد أصباغ تصور الحمض النووي مثل بروميد Ethereum أو cyber green من كاسيت agros لأنها يمكن أن تغير خصائص ترحيل الحمض النووي للأجزاء المرتبطة بالمحول المتشعب. يمكن أيضا استخدام بروتوكولات اختيار الحجم القياسية القائمة على هلام agros لهذه الخطوة من البروتوكول لإعداد الرحلان الكهربائي للحمض النووي على شريط أسيت AROS الخالي من الصبغة بنسبة 2٪. قم بإنشاء بروتوكول جديد في وحدة تحكم Pippin Prep وحدد خيار علامة 2٪ DF L ككاسيت المفضل.

ثم قم بتمكين خيار استخدام المعايير الداخلية وتحقق من تطابق رقم المسار المرجعي مع أرقام المسار لعزل شظايا الحمض النووي التي تتراوح من 150 زوجا أساسيا و 400 زوج أساسي. حدد خيار النطاق كوضع التجميع وأدخل معلمات الحد التالية: 135 لبدء الزوج الأساسي ، و 410 لنهاية الزوج الأساسي ، و 240 لمخالب الزوج الأساسي. هذا يوجه الجهاز لمحاذاة المجال الكهربائي مع منفذ إخراج الشطف الكهربائي.

عندما تنتقل شظايا الحمض النووي داخل هذا النطاق بالقرب من المخرج. بعد حفظ ملف البروتوكول ، قم بإعداد كاسيت الجل وآبار تحميل العينة للأداة باتباع إجراءات التشغيل القياسية من Pippen Prep عند إعداد الأداة. قم بإعداد عينات الحمض النووي للرحلان الكهربائي عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من علامة الحمض النووي إلى 30 ميكرولتر من عينة معينة بعد الربط لتحميل المخاليط على كاسيت الجل.

أولا ، قم بإزالة 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي من كل عينة. حسنا ، استبدل الحجم عن طريق سحب كل خليط علامة عينة سعة 40 ميكرولتر في آبار فردية. عند العودة إلى وحدة التحكم، قم بتحميل البروتوكول المحفوظ واضغط على ابدأ لبدء الرحلان الكهربائي.

عندما يصل البرنامج إلى الزوج الأساسي 240 ، اجمع خطوة الإيقاف المؤقت يدويا 40 ميكرولترا من الوحدة من كل منفذ إخراج باستخدام ماصة. قم بتسمية هذه الكسور على أنها كسر المكتبة السفلي. بعد جمع كسور المكتبة السفلية ، اغسل منافذ المخرج على الفور بإضافة 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي الجديد.

سحب المخزن المؤقت لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل ، ثم شفط الشبكة. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين لإزالة جميع آثار أنواع الحمض النووي قصيرة الطول من المنافذ. أضف الآن 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي إلى العينة.

حسنا ، أغلق المنافذ elucian واضغط على زر التشغيل لاستئناف العملية السريعة. عند الانتهاء من برنامج Ellucian في إعداد الزوج الأساسي 410 ، اجمع 40 ميكرولترا من الإنويت من جميع منافذ المخرج وقم بتسمية هذه الكسور على أنها جزء المكتبة العلوي. في هذه المرحلة ، يتم تنقية كسرين المكتبة بالهلام وبالفعل لتحويل ثنائي الكبريتيت.

باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا ، قم بإجراء مقايسة تحويل ثنائي الكبريتيت على كلا كسرين المكتبة. في الخطوة الأخيرة من عملية التحويل ، قم بمسح عينات الحمض النووي في 40 ميكرولترا من الماء الحر من الحمض النووي. بعد تحويل ثنائي الكبريتيت ، ستخضع شظايا مكتبة الحمض النووي الناتجة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتخصيب باستخدام البادئات التي تهجن في نهايات المحول لكل جزيء من جزيء الحمض النووي.

للتحضير للتخصيب PCR أولا ، أضف 160 ميكرولترا من مزيج PCR الرئيسي إلى كل 40 ميكرولتر من عينة محولة من الكبريتيد المعطاة. ثم قسم خليط 200 ميكرولتر الناتج إلى أربعة حصص سعة 50 ميكرولتر. في أنابيب PCR منفصلة.

ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري وقم بتضخيم قالب الحمض النووي المحول. بعد التخصيب ، اسحب منتجات PCR الأربعة بعد PCR في أنبوب واحد سعة 1.5 مليلتر وقم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR التجارية. إذا تم استخدام مجموعة استخراج الطور الصلب للحبة المغناطيسية لتنقية منتجات PCR ، فقم بتعديل إجراءات التشغيل القياسية عن طريق خلط منتجات PCR المدمجة في المكتبة السفلية أولا مع 1.7 ضعف حجمها الإجمالي في الخرز.

ثم امزج منتجات PCR للمكتبة العلوية المدمجة مع 1.1 ضعف حجمها الإجمالي في الخرز. ثم اتبع بروتوكول الشركة المصنعة حتى خطوات غسيل الإيثانول بنسبة 70٪ حيث يجب تغيير كل حجم من أحجام الغسيل إلى 800 ميكرولتر في الخطوة الأخيرة من عملية التنقية. قم بتخفيض الحمض النووي ب 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف الخالي من الحمض النووي.

قم بتخزين المكتبات المنقاة عند سالب 20 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليها باستخدام مقايسة قائمة على التألق انتقائية للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، حدد كمية محتوى الحمض النووي بعد التخصيب لكل جزء من المكتبة. علاوة على ذلك ، قم بتقييم حجم مكتبة ما بعد التخصيب وجودتها باستخدام محلل حيوي. احسب مولارية الحمض النووي الفعالة لجزء معين من المكتبة باستخدام متوسط طول الحمض النووي المعبر عنه في أزواج القواعد.

بمجرد معرفة المولارية ، استخدم الماء الحر للحمض النووي لتخفيف كل جزء من المكتبة العلوي والسفلي المقابل إلى تركيزين نهائيين نانوموليين. اجمع أزواج المكتبة السفلية والعلوية في أنبوب واحد لإنشاء خليط مكتبة ذو فتحتين نانومولية بسعة 20 ميكرولترا لكل منهما. العينة المجمعة جاهزة الآن لتشغيل التسلسل.

في المقايسات المتعلقة بالتسلسل ، بما في ذلك E-R-R-B-S ، تعد جودة وتوزيع حجم جزيئات المكتبة العلوية والسفلية من العوامل الرئيسية في تحديد جودة بيانات التسلسل النهائية. عند مقارنتها ببروتوكولات استخراج الهلام اليدوية التقليدية ، فإن جهاز استخراج الهلام الآلي المستخدم في بروتوكول E-R-R-B-S سينتج توزيعا ثابتا للحجم ويقلل من احتمالية تلوث العينات المتقاطعة. بعد ذلك ، عند إرسال جزيئات المكتبة المحولة لكبريتيت BIS لتسلسل البيانات الأولية من جميع خيوط الحمض النووي تظهر أنه بالنسبة لأي خيط معين ، تزداد جودة البيانات لكل موضع نيوكليوتيدات بشكل كبير بعد النيوكليوتيدات الثلاثة الأولى مباشرة.

نظرا لأن تسلسل الإجماع لهذه النيوكليوتيدات الثلاثة تم تعيينه مع CGG للغالبية العظمى من جزيئات المكتبة ، تشير البيانات إلى أن بروتوكول E-R-R-B-S قد أنتج مجموعة مكتبة تحتوي على مجموعة مرغوبة من الأجزاء الجينومية التي تحيط بها في الغالب. مع MSP ، ينتهي ملخص تقييد واحد من وجهة نظر عين الطائر. يمكن لبروتوكول E-R-R-B-S أن ينتج بيانات دقة زوج أساسي لمواقع مثيلة السيتيدين عبر الجينوم بأكمله.

على سبيل المثال ، يظهر الكروموسوم 12 هنا. يغطي البروتوكول تمثيلا مخفضا ل CPGs على مستوى الجينوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مكتبات E-R-R-B-S لإنشاء بيانات مثيلة D-N-A-C-P-G ذات الدقة الأساسية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تبدأ ب DNA عالي الجودة ، وتضمين جميع الخطوات الموضحة ، والتحقق من كفاءة تحويل الكبريتات الثنائية وتسلسلها باستخدام المعلمات الموصى بها. لا تنس أن العمل مع الفينيل والكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات الشائعة ، مثل العمل في غطاء المحرك الكيميائي والتخلص المناسب من النفايات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل spyro أو epitype المصفوفة الجماعية للتحقق من صحة النتائج. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء توصيف التعبير الجيني لتحديد الأهمية البيولوجية لأنماط مثيلة الحمض النووي المكتشفة.

مكنت القدرة على توليد الحمض النووي لدقة زوج القاعدة وأنماط المثيلة من كميات محدودة من مواد الإدخال من تحديد ملامح مجموعات الخلايا النادرة التي لم يكن ممكنا من قبل. كما جعلت من الممكن تحديد ملامح مجموعات كبيرة من العينات السريرية لاستكشاف التنظيم اللاجيني والوساطة وعدم تجانس المرض.