الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من خلايا الدم. يتم تحقيق ذلك عن طريق إثراء الخلايا السلفية المكونة للدم CD 34 الإيجابية من الدم. الخطوة الثانية هي نقل خلايا CD 34 مع فيروس سيندي الذي يحتوي على عوامل نسخ.

بعد ذلك ، يتم اشتقاق الخلايا الجذعية العصبية باستخدام وسيط انتقائي. الخطوة الأخيرة هي تفريق الخلايا الجذعية العصبية المستحثة إلى خلايا عصبية ، وخلايا أستروبليا ، وخلايا الدبقية قليلة التغصن. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي لتوصيف الخلايا الناتجة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية ، مثل مدة الخلايا العصبية مباشرة من الخلايا الليفية ، وكذلك توليد IPS ، هي أن هذه الطريقة تتجاوز العملية الشاقة لتوليد IPS وحسابها ، ولكنها لا تزال توفر كمية كبيرة من الخلايا العصبية التي يمكن أن ترتبط وتتمايز إلى الخلايا العصبية. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظت أن خلايا التصوير المقطعي المحوسب 34 المرفقة تظهر في الواقع مشابهة جدا للخلايا السلوجينية العصبية الأولية المزروعة مما يدل على أن الإجراء سيكون مشاة البحرية ، وهو فني من حياتي. بعد عزل خلايا CD 34 من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة وفقا للتعليمات الواردة في بروتوكول النص ، ابدأ عملية زراعة خلايا CD 34 بواسطة Resus ، وتعليق خلايا CD 34 في وسائط CD 34 ثم زرع الخلايا في صفيحة 24 بئر بثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في مليلتر واحد من الوسط.

بعد الحضانة لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، اجمع الخلايا العائمة وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 110 مرات G في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط صيانة CD 34 الجديد. انظر صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا في وقت واحد 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في مليلتر واحد من الوسط ، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة خمسة أيام إضافية ، لتحل محل نصف الوسط كل يومين.

عن طريق شفط النصف العلوي من المادة الطافية بعناية بينما توجد خلايا CD 34 في قاع الآبار كما هو موضح هنا في اليوم الخامس. بعد الطلاء ، اجمع خلايا CD 34 وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 170 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا كما كان من قبل وزرع صفيحة جديدة من 24 بئر في وقت واحد 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في مليلتر واحد من الوسائط. بعد ذلك ، قم بإذابة مجموعة إعادة برمجة IPS Sendi لضبط cyto.

عن طريق غمر قيعان الأنابيب أولا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ثم إذابة الثلج تماما في درجة حرارة الغرفة. لفترة وجيزة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب ووضعها على الجليد. قم بإعداد خليط فيروس سينداي عن طريق خلط الحجم الموصى به لكل فيروس مدرج في شهادة التحليل للدفعة المقابلة.

يوصى بتعدد العدوى 15. أضف مزيج فيروس سينداي إلى كل بئر من خلايا CD 34. ثم اخلطي الآبار عن طريق هز الطبق برفق.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ بعد 24 ساعة. راقب كفاءة التحويل. لاحظ أن مجاميع الخلايا والمجالات مثل تلك الموضحة هنا هي مؤشرات على التحويل الناجح.

ثم قم باحتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة خمسة إلى سبعة أيام حتى تظهر الخلايا المرفقة وتصل إلى 30 إلى 50٪ التقاء كما هو موضح هنا كل يومين. قم بتغيير نصف الوسط عن طريق نقل النصف العلوي من الوسط بعناية إلى بئر آخر. إذا تم نقل كرات الخلية إلى الجديدة ، أضف كمية متساوية من الوسط الطازج.

تحقق من طلاقة الخلايا باستخدام المجهر المقلوب. عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 30 إلى 50٪ ، قم بشفط المادة الطافية والاحتياطي ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط السلف العصبي إلى كل بئر لعمل لوحة احتياطية باستخدام الكرات الموجودة في جهاز الطرد المركزي الطافي ، وهو الطاف الاحتياطي عند 170 مرة G لمدة 10 دقائق. ثم قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في صفيحة متوسطة للسلف العصبي في لوحة مطلية ب 24 بئر.

كما كان من قبل ، قم بتغيير الوسط في كل صفيحة من الخلايا كل يومين حتى تصل الخلايا إلى التقاء 60 إلى 80٪. عادة بعد أسبوع واحد. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء المطلوب ، قم بشفط المادة الطافية وأضف ملليلترا واحدا من وسط الخلايا الجذعية العصبية لكل منها.

حسنا ، ثم قم بفصل الخلايا باستخدام مكشطة الخلية ، متبوعة بسحب لطيف جدا. بعد ذلك ، انقل الخلايا من بئر واحد من صفيحة 24 بئر إلى بئر واحد من ستة. لوحة حسنا.

أضف ملليلتر آخر من المتوسط إلى البئر وبعد تكرار الإجراء لجميع الآبار ، ضع لوحة الآبار الستة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪. قم بتغيير الحجم الكامل للوسط كل يومين حتى تصل الخلايا إلى 60٪ من التقاء وبعد ذلك تفصل الخلايا وتجددها بنسبة واحد إلى ثلاثة كما هو موضح للتو لتجميد جزء من الخلايا الجذعية العصبية غير المتمايزة. أولا ، قم بإعداد وسط تجميد الخلايا الجذعية عن طريق إضافة 20٪ أكسيد ثنائي ميثيل كبريت أو DMSO إلى وسط الخلايا الجذعية العصبية ووضعها على الجليد.

ثم قم بفصل الخلايا في لوحة الآبار الستة. باستخدام مكشطة خلية وماصة لطيفة. احتفظ بكمية من المعلق لعدد الخلايا ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 170 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء دوران الخلايا ، واحسب الخلايا في حصة التعليق باستخدام مقياس الدم أو مقياس الخلايا الخلوي أو عداد الخلايا الآلي واحسب حجم الوسط المطلوب لإعطاء تركيز خلية واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

بعد انتهاء الدوران ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط الخلايا الجذعية العصبية في وقت واحد 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر. ثم أضف حجما متساويا من الماصة المتوسطة المتجمدة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة بحجم مليلتر واحد في قارورة التبريد وقم بتجميد الخلايا في وعاء تجميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. عندما تصل الخلايا الجذعية العصبية في صفيحة الآبار الستة إلى 80٪ من التقاء ، افصلها باستخدام شرطي مطاطي ثم انفصلها عن طريق سحب العينات اللطيف.

تجمع معلق الخلية في أنبوب معقم. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو مقياس الخلوي أو عداد الخلايا الآلي واضبط تركيز تعليق الخلية إلى واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر مع وسط الخلايا الجذعية العصبية. ثم ماصة ملليلتر واحد من تعليق الخلية على ليسين بولي D وانزلاق غطاء مغلف في بئر واحد من صفيحة 24 بئر بعد تكرار الإجراء للعدد المطلوب من الآبار.

احتضن كما كان من قبل لمدة 24 ساعة. بعد انقضاء وقت الحضانة ، استنشق الوسائط واستبدلها بالتمايز العصبي. يحتضن المتوسط لمدة أسبوعين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون يغير الوسط مرتين في الأسبوع بعد أسبوعين.

يجب أن تكون الخلايا الجذعية العصبية متمايزة تماما كما هو موضح هنا وتكون جاهزة للتطبيقات النهائية مثل تلطيخ التألق المناعي. تظهر الصورتان الأوليان أن الخلايا الجذعية العصبية تعبر عن التعش في SOX الثاني. بينما توضح الصورة الثالثة أن OCT four لم يتم التعبير عنه ، يتم استخدام DPI كعلامة نووية ويمثل شريط المقياس 200 ميكرون.

بعد اتباع بروتوكول التمايز الموضح في الفيديو ، تعبر الخلايا العصبية المتمايزة عن علامة الخلايا العصبية بيتا ثلاثة توبولين. يمكن أيضا تمييز الخلايا الجذعية العصبية البشرية إلى خلايا دبقية. عند التمايز إلى خلايا نجمية ، تعبر الخلايا عن العلامة النجمية GFAP.

أخيرا ، في هذه الصورة ، تم تمييز الخلايا إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن وتعبر عن علامة الخلايا قليلة التغصن. يا أربعة. بمجرد إتقان توليد الخلايا الجذعية العصبية البشرية المستحثة من الدم المحيطي يمكن إجراؤه في غضون ثلاثة أسابيع تقريبا.

إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن أن تكون الخلايا الجذعية العصبية أكثر تمايزا والطريقة غير واضحة من خلال عمليات توليد IPS الطويلة والمعقدة ويمكن أن تكون خيارا سهلا لتوليد ثقافات عصبية محددة للمريض بعد تطورها. طريقة مسار التقنية هذه للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف نمذجة زراعة الخلايا الفردية لمختلف الاضطرابات العصبية ، والتي قد تمثل بشكل أفضل الاختلافات الجينية في اضطرابات معينة ، خاصة من عينات المرضى الفردية.