تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم كل من استجابات الخلايا التائية المستجيبة والذاكرة باستخدام فحوصات إنترفيرون جاما L المزروعة قصيرة وطويلة المدى على التوالي. يتم تقييم استجابة الذاكرة المركزية عن طريق زراعة خلايا الدم المحيطية الأبقار أحادية النواة تحت التحفيز المستضد لمدة 13 يوما. تسمح الثقافة طويلة المدى بحدوث استجابات الخلايا التائية المستجيبة وتقليلها.

يضاف الإنترلوكين الثاني إلى الثقافات للحفاظ على خلايا الذاكرة التائية. في اليوم 13 ، يتم نقل الخلايا طويلة المدى إلى صفائح بقعة L مطلية بجسم مضاد لالتقاط جاما IFN. يتم تقييم استجابة الخلايا طويلة المدى لمستضدات البكتيريا الفطرية الفردية إما في وجود أو عدم وجود خلايا تقدم مستضد ذاتي المنشأ.

عزل APCs من p BMCs الطازجة عن طريق الالتزام في اليوم 13. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم استجابة pbmc المعزولة حديثا في ظل ظروف خارج الجسم الحي كارتباط بين استجابات المستجيب. في العديد من الدراسات ، ثبت أن استجابة البوت البقري المزروعة على المدى الطويل للمستضدات الفطرية بعد التطعيم ترتبط ارتباطا إيجابيا بفعالية اللقاح.

أيضا ، تحتوي مزارع الخلايا التائية طويلة المدى بشكل أساسي على خلايا تائية للذاكرة المركزية في كل من البشر والماشية من أجل إجراء اختبار بقعة L المزروعة على المدى الطويل. يتم جمع 60 مل من الدم من المصابة أو الملقحة عن طريق بزل الوريد الوداجي ويتم عزل P BMCs حسب الكثافة. الطرد المركزي المتدرج.

يجب تعديل تركيز الخلية إلى 4 ملايين خلية لكل مل. في وسائط RPMI الكاملة تبدأ بطلاء 500 ميكرولتر من المستضدات البكتيرية الدقيقة ، في هذه الحالة TB 10.4 والمستضد 85 A ومشتق البروتين المنقى من ثقافة em bovis المسمى PPDB. ثم أضف 500 ميكرولتر من pbmc معزولة من كل مع أربعة مكررات لكل.

لاحظ أنه يجب تحفيز جميع الآبار. ليست هناك حاجة إلى ضوابط مثل عدم التحفيز أو الميتوجينات في هذه الخطوة ، احتضن اللوحة عند 39 درجة مئوية درجة الحرارة الطبيعية للماشية لمدة 13 يوما. في اليومين الثالث والسابع ، تخلص من 500 ميكرولتر من كل بئر ماصة بعناية حتى لا تزعج طبقة الخلية في قاع الآبار.

قم بتجديد وحدة التخزين باستخدام مؤشر مديري المشتريات الكامل الذي يحتوي على IL Two. ضع اللوحة في الحاضنة في اليوم 10 ، تخلص من 750 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر يتم تجديدها ب RPMI كامل بدون أي IL اثنين في اليوم 12 ، وقم بفك الماصة وتخلص من مل واحد من المادة الطافية من كل بئر تم تجديده ب RPMI كامل بدون IL اثنين. قم أيضا بإعداد لوحة البقعة L ليتم تغليفها بالجسم المضاد IFM Gamma ، الماصة الأولى 15 ميكرولتر من الكحول 35٪ في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات ، وتزيد هذه الخطوة من تعريف البقعة.

يغسل جيدا ست مرات باستخدام 300 ميكرولتر من PBS. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الملتقط بمعدل ثمانية ميكروغرام لكل مل في PBS. يجب أن يتم سحب العينات بعناية أثناء جميع الإجراءات ، وعدم السماح لأطراف الماصة بلمس أو إتلاف الغشاء الموجود في الجزء السفلي من لوحة وضع البئر داخل كيس بلاستيكي واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم 13 ، اجمع 60 مل من الدم عن طريق ثقب الوريد الوداجي من نفس التي تم أخذ عينات منها في اليوم الأول. اعزل pbmc واضبط التركيز على 2 مليون خلية لكل مل. قم بتسمية لوحة البقعة L بشكل صحيح لكل مجموعة من العينات.

الخلايا طويلة المدى بالإضافة إلى APCs خلايا طويلة الأمد بدون APCs وخلايا خارج الجسم الحي. تخلص من الجسم المضاد الملتقط من آبار غسيل لوحة Ellis الموضعية مع 300 ميكرولتر من PBS المحتوية على توين. كرر ست مرات ، وتخلص من سائل الغسيل والماصة.

50 ميكرولترا من p BMCs المعزولة حديثا في الآبار المخصصة للخلايا طويلة المدى. بالإضافة إلى ناقلات الجنود المدرعة. قم بسد الآبار الأخرى للوحة البقعة L ب 200 ميكرولتر لكل بئر من RPMI الكامل لتقييم النمط الظاهري للخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي بالتوازي مع لوحة فحص البقعة L.

50 ميكرولترا من الخلايا المعزولة حديثا في صفيحة بئر 96 قاع مستديرة مصنفة بشكل صحيح. هذا اختبار إضافي يتم إجراؤه جنبا إلى جنب مع مقايسة البقعة الصفراء لتحديد النمط الظاهري للخلايا المستجيبة. احتضان الصفائح لمدة 90 دقيقة عند 39 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ ، مما يسمح للخلايا العارضة للمستضد بالالتصاق.

احتضن أيضا 200 مل من RPMI الكامل لتسخينه خلال خطوة الحضانة التي تستغرق 90 دقيقة. احصد الخلايا المستزرعة على المدى الطويل من صفيحة 24 بئر. الجمع بين التكرارات الرباعية من كل في أنبوب مخروطي واحد 15 مل.

جهاز الطرد المركزي الأنابيب لمدة خمس دقائق عند 400 Gs.تخلص من المادة الطافية عن طريق انعكاس الأنبوب ، وقم بإزاحة حبيبات الخلية وأضف خمسة مل من PBS ، وأعد تعليق الحبيبات برفق إذا لزم الأمر. اغسل الخلايا مرتين ثم اضبط تركيز الخلية على 200 ، 000 خلية لكل مل. بعد الحضانة لمدة 90 دقيقة ، خذ لوحة LPO و RPMI الكامل من الحاضنة.

ضع لوحة LPO على شاكر اللوحة لمدة 30 ثانية. ثم قم بإزالة الخلايا غير اللاصقة بواسطة ماصة انعكاس اللوحة 150 ميكرولتر لكل بئر من RPMI الدافئ الكامل. رج الطبق وتخلص من سائل الغسيل.

كرر ثلاث مرات ، وتخلص من أكبر قدر ممكن من السائل ، وأضف مائة ميكرولتر لكل بئر من كل مستضد في الآبار المناسبة التي تحتوي على ناقلات الجنود الملتصقة الملتصقة. ثم ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر من تعليق الخلايا المستزرعة على المدى الطويل. 200،000 خلية لكل مل في الآبار المصنفة على أنها خلايا طويلة المدى بالإضافة إلى APCs.

تأكد من أن الخلايا طويلة المدى المضافة في هذه الخطوة هي من نفس مثل APCs الموجودة بالفعل في البئر. لا تخلط APCs والخلايا المستنبتة طويلة الأمد من مختلفة. أيضا ، ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر من معلق الخلايا المزروعة طويل الأمد بتركيز 200،000 خلية لكل مل في الآبار بدون APCs لتقييم الاستجابات طويلة المدى.

في حالة عدم وجود عرض للمستضد ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الخلايا قصيرة المدى ، بالإضافة إلى عزلها حديثا وتعديلها إلى 2 مليون خلية لكل مل لتقييم الاستجابة خارج الجسم الحي. في حالة إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي ، اغسل القاع المستدير 96 ، ولوحة البئر وأضف الخلايا والمستضدات المعزولة حديثا على المدى الطويل إلى الآبار باتباع نفس الإجراءات. يعمل في لوحات احتضان لوحة IFN Gamma LPO بين عشية وضحاها عند 39 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.

تأكد من أن الألواح مسطحة ولا تكدس الألواح في اليوم 14. تخلص من السوائل من الآبار وغسل الألواح ست مرات مع 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS الذي يحتوي على توين يوضع على شاكر اللوحة في كل مرة لمدة 10 ثوان قبل الغسيل وبينه. ثم اغسل مرة واحدة بنفس الحجم من الماء المقطر وست مرات إضافية باستخدام PBS الذي يحتوي على توين.

أخيرا ، اغسل الخلايا مرتين ب 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS. قم بإزالة سائل الغسيل عن طريق النقر على اللوحة على المناشف الورقية أو الفوط الماصة. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من الجسم المضاد للكشف بخمسة ميكروغرام لكل مل مخفف في PBS مع 1٪ ألبومين مصل البقر.

احتضن الأطباق لمدة 120 دقيقة عند 39 درجة مئوية. خلال خطوة الحضانة هذه ، قم بإعداد محلول الفوسفاتيز القلوي من معيار مجموعة VTA stain A BC AP باتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل 30 دقيقة من الاستخدام أو بعد 90 دقيقة من إضافة الجسم المضاد للكشف إلى الآبار. قم بتخفيف الكاشف في PBS الذي يحتوي على توين بعد 120 دقيقة من الحضانة ، وتخلص من الجسم المضاد للكشف عن طريق ألواح غسيل انعكاس اللوحة ست مرات مع 300 ميكرولتر لكل بئر من PBS المحتوية على المراهقين.

قم بإزالة سائل الغسيل عن طريق النقر على اللوحة على مناشف ورقية. ثم أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الفوسفاتيز القلوي. احتضن الأطباق لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من السائل واغسل كل طبق ست مرات باستخدام PBS المحتوي على توين. قم بإعداد محلول الركيزة من مجموعة الركيزة AP الزرقاء المتجهة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. قم بتخفيف الكواشف في المخزن المؤقت 0.1 molar tris HCL عند درجة الحموضة 8.2.

ماصة 50 ميكرولتر من الركيزة D.كل بئر يحتضن في درجة حرارة الغرفة حتى يبدأ اللون الأزرق في التطور حوالي 30 دقيقة. تخلص من السوائل واغسل الأطباق بكميات وفيرة من الماء المقطر. قم بإزالة اللوحة السفلية لكشف الغشاء ، واغسل الآبار مرة أخرى ، واترك اللوحة تجف في الهواء.

قم بقياس الاستجابة باستخدام محلل صور البقع المناعية أو احتفظ بالأطباق في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى يتم قياس الاستجابة. بسبب الاستقرار العالي للتفاعل ، يتم الحفاظ على جودة الركيزة لعدة سنوات. في حالة تقييم النمط الظاهري واستجابة السيتوكين عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بإجراء إجراءات تلوين قياسية للخلايا المطلية في القاع المستدير 96 ، ممثل لوحة البئر TCM في وجود أو عدم وجود APCs ، يتم عرض استجابات مأهولة من الجسم الحي IFN جاما L من المصابة غير المصابة.

يتم تقييم الاستجابات المحددة ل m bovis بواسطة PBDB أو ESAT ستة ، CFP 10 التحفيز المستضدي. البقع الموجودة في الجزء السفلي من الألواح هي المنتج الملون لمقايسة البقعة الصفراء. تمثل كل بقعة عادة خلية فردية منتجة للسيتوكين ، مما يوفر مقياسا كميا للخلايا التائية المنتجة ل IFN جاما مع خلايا من المصابة.

الواضح أن استجابات IFN الموضعية طويلة المدى التي يتم تقديمها كخلايا مكونة للبقع أو SFCs يتم تصويرها بوضوح القليل من إنتاج جاما IFN استجابة لتحفيز المستضد مع خلايا من الماشية غير المصابة ومع الخلايا غير المحفزة من الماشية المصابة أو غير المصابة. يجب أن تحدث استجابة قوية للخلايا التائية استجابة لميتوجين الحشائش كما هو موضح في الطب الصيني التقليدي واستجابات خارج الجسم الحي ل PPDB و ESAT ستة. تم اكتشاف CCFP 10 من جميع المصابة ب 3M bovis وتم اكتشاف الحد الأدنى من استجابات الطب الصيني التقليدي وخارج الجسم الحي من التحكم.

كان وجود ناقلات الجنود المدرعة مطلوبا لاستجابات الطب الصيني التقليدي المثلى من قبل المصابة كما يتضح من الاستجابات المنخفضة بشكل كبير من قبل الخلايا طويلة المدى المستزرعة. في حالة عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة الذاتية ، تم تقديم خلايا مكونة للبقع من المصابة بالعدوى وغير المصابة. تم حساب عدد SFCs من كل من خلال متوسط عدد SFCs عند 10 إلى الخلايا السادسة في عينات مكررة استجابة ل PPDB مطروحا منه اختلفت الاستجابة المعنية للوسائط وحدها الاستجابات بناء على حالة العدوى أو وجود أو عدم وجود APCs وطول الثقافة ، أي الثقافة طويلة المدى مقابل الثقافة خارج الجسم الحي.