انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن استجابات الخلايا التائية للمستضدات ذات الأهمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الترميز الأول باستخدام الأجسام المضادة الملتقطة. الخطوة الثانية من الإجراء هي إضافة الخلايا والمستضدات ذات الأهمية ثم احتضانها طوال الليل.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي إضافة الأجسام المضادة للكشف. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تطوير اللوحة باستخدام كواشف الركيزة وتحليل البقع. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج اختارت السيتوكينات ذات الأهمية من خلال تحليل وحدات تكوين البقع.

مرحبا ، اسمي Dr.Ki ريختر وأنا مدرس أبحاث في مختبر الدكتور وندر دريك في جامعة فاندربيلت في قسم الأمراض المعدية. نعرض اليوم تقنية Ellie Spot ، والمعروفة أيضا باسم مقايسة البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم. ستعرض غرف الدكتور أصفهان وتيفاني كون هذه التقنية لك اليوم.

من أجل الحفاظ على معايير زراعة الخلايا ، قم بإجراء عمليات التلاعب في ظل ظروف معقمة في غطاء المحرك ، وافتح لوحة بقعة الحليف واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بإعداد محلول طلاء للجسم المضاد الملتقط في PBS. تخلط جيدا عن طريق الدوامة للراحة.

انقل محلول الجسم المضاد إلى خزان للقناة متعددة القنوات ، والماصة ، وتناول 100 ميكرولتر من محلول الطلاء في كل منها. أغلق الطبق جيدا بالبرفيل وضعه في الثلاجة طوال الليل. هذه الألواح المطلية بالأجسام المضادة جيدة لأسابيع.

تملي القاعدة الأساسية أنه يمكن استخدام اللوحة إذا كان لا يزال هناك سائل متبقي في الآبار. لتحضير الخلايا لهذا الفحص ، قم بتلطيخ الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي المعزولة حديثا باللون الأزرق الثلاثي للبقاء وعدها ، قم بوضع pbmc عند 2 مليون خلية لكل مليلتر في 10 وسائط لدينا واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. من أجل تتبع التجربة ، قم بتسمية غطاء لوحة بقعة علي برقم تعريف العينة وظروف البئر والتاريخ.

اغسل اللوحة ست مرات باستخدام PBS معقم باستخدام طريقة التفريغ واللطخة. احرص على عدم رش اللوحة أثناء الإغراق ، فقد يتسبب ذلك في تحول آبار الصفيحة إلى اللون الأرجواني. أضف 20 وسائط إلى كل بئر واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

أثناء احتضان اللوحة ، عد الخلايا التي استراحت طوال الليل. حصاد pbmc عن طريق الطرد المركزي. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 10 وسائط بتركيز 1 مليون خلية لكل مليلتر.

بعد حضانة ساعة واحدة للوحة بقعة الحليف ، قم بإزالة وسائط R 20 باستخدام طريقة التفريغ واللطخة. احرص على عدم رش الطبق أثناء الإغراق. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل منها.

حسنا ، اتبع التصميم التجريبي مع إضافة الببتيدات والمستضدات إلى آبار الاختبار المقابلة. قم دائما بتضمين التحكم السلبي في الخلايا التي لا تحتوي على ببتيدات وأيضا آبار التحكم الإيجابية مع إضافة الهيماجلوتينين النباتي. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

اغسل الطبق ست مرات ب 150 ميكرولتر من XPBS واحد باستخدام طريقة التفريغ واللطخة. أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من الطبق وضع الطبق في الثلاجة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. في هذه الأثناء ، قم بإعداد محلول الأجسام المضادة للبيوتين في PBS.

أخرج لوحة ALI الموضعية من الثلاجة وتخلص من PBS عن طريق وضعها في سلة النفايات. احرص على عدم رش اللوحة أثناء إلقاء محلول الأجسام المضادة للبيوتين في كل بئر واحتضان اللوحة في غطاء مزرعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل الطبق ست مرات باستخدام PBS باستخدام طريقة التفريغ واللطخة في الغسيل الأخير.

اترك PBS على الطبق الآن. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة STREPTAVIDIN في PBS ، مع التأكد من دوامة المحلول للخلط. حسنا ، تخلص من آخر غسول PBS من الآبار وارسم لوحة بقعة ALI.

أضف محلول الأجسام المضادة للستربتافيدين إلى كل بئر واحتضان اللوحة في غطاء مزرعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. من أجل إزالة الأجسام المضادة الزائدة للتريفان ، اغسل اللوحة ست مرات باستخدام PBS باستخدام طريقة التفريغ واللطخة في الغسيل الأخير ، وقم بقيادة PBS على اللوحة. نظرا لحساسية الضوء لمحلول الركيزة الفوسفاتيز القلوي B-C-I-P-M-B-T.

اعمل في الظلام عند تحضير محلول الساق كما هو موضح من قبل الشركات المصنعة في تعليمات مجموعة ركيزة الفوسفاتيز القلوية ، وتخلص من PBS المتبقي من الآبار وصمة عار على لوحة البقعة. أضف محلول الركيزة إلى كل بئر وقم بتشغيل الضوء. بعد خمس إلى 10 دقائق من تطور اللون ، اترك الكواشف تبقى على اللوحة حتى تبدأ البقع في التحول إلى اللون الأرجواني وتصبح داكنة تماما.

يستغرق هذا ما يصل إلى 20 دقيقة. اغسل طبق علي ثلاث مرات بماء الصنبور واتركه حتى يجف في الهواء. تحتوي كل لوحة على تحكم إيجابي وتحكم سلبي وببتيد ذي أهمية يتم إجراؤه على الأقل في تكرار.

آبار التحكم الإيجابية هي لون أرجواني غامق يعكس طبقة ملتقرة من الخلايا وبالكاد أي خلفية بيضاء. آبار التحكم السلبية ليس لها خلفية أرجوانية ولا بقع كما هو متوقع. توضح آبار عينة الاختبار الاستجابات الخلوية للببتيدات الميكروبية هنا.

تمثل البقع الأرجوانية خلية واحدة سريعة الاستجابة تعبر عن السيتوكين محل الاهتمام عند إجراء تقنية LA البقعية. يرجى الحرص على عدم ثقب الغشاء بأطراف الماصة أو السماح لصفيحتك بالجفاف لأن ذلك سيؤدي إلى خلفية عالية.