انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن استجابات الخلايا التائية للمستضدات المستهدفة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الترميز باستخدام أجسام مضادة لالتقاط الخلايا. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إضافة الخلايا والمستضدات المستهدفة ثم تحضينها طوال الليل.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة أجسام مضادة للكشف. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تحميض اللوح باستخدام كواشف الركيزة وتحليل البقع. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تحدد السيتوكينات المستهدفة من خلال تحليل وحدات تكوين البقع.

مرحباً، اسمي الدكتورة Ki Richter وأنا محاضرة بحثية في مختبر الدكتور Wonder Drake بجامعة Vanderbilt في قسم الأمراض المعدية. سنقوم اليوم بشرح تقنية الـ Ellie Spot، والمعروفة أيضاً بمقايسة البقع المناعية المرتبطة بالإنزيم. ستقوم الدكتورة Isfahan chambers وتيفاني Cone بتوضيح هذه التقنية لكم اليوم.

من أجل الحفاظ على معايير زراعة الخلايا، قم بإجراء العمليات تحت ظروف معقمة داخل غطاء التدفق الصفائحي، وافتح لوحة بقع من نوع ally spot plate واغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بتحضير محلول طلاء من الأجسام المضادة الماصة في PBS. اخلط المزيج جيداً باستخدام جهاز vortex لضمان التجانس.

انقل محلول الأجسام المضادة إلى خزان الماصة متعددة القنوات، ثم وزع 100 µL من محلول الطلاء في كل بئر. أغلق اللوحة بإحكام باستخدام غشاء لاصق وضعها في الثلاجة طوال الليل. تظل هذه الألواح المطلية بالأجسام المضادة صالحة للاستخدام لعدة أسابيع.

تشير القاعدة العامة إلى إمكانية استخدام الطبق طالما بقي سائل في الآبار. ولتحضير الخلايا لهذا المقايسة، يتم صبغ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المعزولة حديثاً باستخدام trien blue لفحص الحيوية وعدّها. تُزرع pbmc بكثافة 2 million cells per milliliter في وسط زراعي، وتُحضن طوال الليل عند 37 °C مع 5% carbon dioxide. ومن أجل تتبع التجربة، يتم وضع ملصق على غطاء الطبق يتضمن رقم تعريف العينة، وظروف الآبار، والتاريخ.

اغسل الصفيحة ست مرات باستخدام PBS معقم باتباع طريقة التفريغ والتربيت. احرص على عدم رش الصفيحة أثناء التفريغ، لأن ذلك قد يؤدي إلى تحول آبار الصفيحة إلى اللون الأرجواني. أضف 20 µL من الوسط الغذائي إلى كل بئر واحضن الصفيحة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

أثناء تحضين الطبق، قم بعدّ الخلايا التي ريحت طوال الليل. قم بحصاد pbmc عن طريق الطرد المركزي. صب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 10 media بتركيز 1 مليون خلية لكل milliliter.

بعد تحضين طبق البقعة التحليلية لمدة ساعة واحدة، قم بإزالة وسط R 20 باستخدام طريقة السكب والتربيت. كن حذراً لتجنب تطاير الوسط من الطبق أثناء السكب. أضف 100 µL من معلق الخلايا إلى كل بقعة.

سنتبع التصميم التجريبي بإضافة الببتيدات والمستضدات إلى آبار الاختبار المقابلة. يجب تضمين ضابط سلبي دائمًا يتكون من خلايا بدون ببتيدات، وأيضًا آبار ضابطة إيجابية مضاف إليها phyto hemagglutinin. تُحضن الصفيحة طوال الليل عند 37 °C مع 5% carbon dioxide.

اغسل الطبق ست مرات باستخدام 150 µL من XPBS باتباع طريقة التفريغ والتجفيف. أضف 100 µL من PBS إلى كل بئر من آبار الطبق، ثم ضع الطبق في الثلاجة أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول الأجسام المضادة المبيوتنة في PBS.

أخرج لوحة بقع ALI من الثلاجة وتخلص من محلول PBS عن طريق نفضه في سلة النفايات. توخَّ الحذر لتجنب رش اللوحة أثناء سكب كمية محددة من محلول الجسم المضاد للبيوتين في كل بئر، ثم حضن اللوحة في غطاء زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل اللوحة ست مرات بمحلول PBS باستخدام طريقة السكب والتجفيف في الغسلة الأخيرة.

اترك محلول PBS على الطبق الآن. قم بتحضير محلول جسيمات STREPTAVIDIN المضادة في محلول PBS، مع التأكد من رج المحلول باستخدام جهاز vortex لضمان المزج. تخلص الآن من غسلة PBS الأخيرة من الآبار وقم بتحديد موقع لوحة ALI spot.

أضف محلول جسيم الستربتافيدين المضاد إلى كل بئر، ثم حضن الطبق في غطاء زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ومن أجل إزالة الفائض من الأجسام المضادة للستربتافيدين، اغسل الطبق ست مرات باستخدام PBS، مع تطبيق طريقة التفريغ والتجفيف في الغسلة الأخيرة، واترك PBS على الطبق. وبالنظر إلى الحساسية الضوئية لمحلول ركيزة الفوسفاتاز القلوي B-C-I-P-M-B-T.

اعمل في الظلام عند تحضير محلول الركيزة كما هو موضح في تعليمات الشركات المصنعة في طقم ركيزة الفوسفاتاز القلوي، ثم تخلص من محلول PBS المتبقي من الآبار وقم بتجفيف لوحة بقع تحليل اللمفاويات (ly spot plate). أضف محلول الركيزة إلى كل بئر وقم بتشغيل الضوء. بعد مرور خمس إلى 10 دقائق من ظهور اللون، اترك الكواشف على اللوحة حتى تبدأ البقع في التحول إلى اللون الأرجواني وتصبح داكنة تماماً.

تستغرق هذه العملية ما يصل إلى 20 دقيقة. اغسل لوحة بقع Ali ثلاث مرات باستخدام مياه الصنبور واتركها لتجف في الهواء. تحتوي كل لوحة على ضابط موجب، وضابط سالب، والببتيد محل الدراسة، حيث يتم إجراء كل منها في مكررات على الأقل.

تظهر آبار الضبط الموجب بلون أرجواني داكن، مما يعكس وجود طبقة متلاصقة من الخلايا مع انعدام الخلفية البيضاء تقريبًا. أما آبار الضبط السالب فلا يوجد بها خلفية أرجوانية ولا بقع، كما هو متوقع. وتوضح آبار عينات الاختبار هنا الاستجابات الخلوية للببتيدات الميكروبية.

تمثل البقع الأرجوانية خلية مستجيبة واحدة تعبر عن السيتوكين المستهدف عند إجراء تقنية بقع LA. يرجى الحرص على عدم ثقب الغشاء برؤوس الماصة أو ترك الطبق يجف، لأن ذلك سيؤدي إلى ارتفاع مستوى الخلفية.