اختبار المقايسة المناعية المضاعفة فلوروميتريك المنهجية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة ضد العوامل المعدية العارضة في حيوانات المختبر. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحضين المصل المراد اختباره مع كرات مجهرية مغلفة بالمستضد. بعد ذلك، يتم تحضين المصل مع جسم مضاد للغلوبولين المناعي نوعي للأنواع وموسوم بالبيوتين، والذي يكشف عن أي معقدات مناعية مكونة من المستضد والجسم المضاد.

بعد ذلك، يتم إضافة محلول FICO eryn Fluor force المسمى بـ streptavidin من أجل الكشف عن أي immunoglobulin مبيوتني، ويتم الحصول على نتائج توضح حالة الأجسام المضادة الإيجابية أو السلبية للعوامل الشائعة في القوارض المختبرية بناءً على الفلورة المتعددة، وصافي درجة المقايسة المناعية، وقيم العينات الفلورية. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل Eliza، في أن MFIA هي مقايسة متعددة، مما يمكن الباحث من فحص ما يصل إلى مائة مقايسة مختلفة في اختبار واحد.

تساهم هذه التقنية في تقليل كمية عينات المصل والمستهلكات المستخدمة في الطرق الحالية، مع زيادة كمية المعلومات المستخلصة من اختبار واحد. لقد خطرت لنا فكرة استخدام هذه الطريقة أثناء اختبار عدد كبير من عينات المصل للكشف عن عوامل متعددة، حيث رغبنا في تقليل المجهود البدني ووقت الاختبار. ستقوم دونـا كوهين، وهي تقنية أولى من مختبرنا، بشرح الإجراء. للبدء، قم بتجهيز المحلولين المنظمين المطلوبين لإجراء المقايسة المناعية الفلورية المتعددة (MFIA).

الأول هو مخفف أولي، يتوفر من شركة Charles River ويحتوي على عوامل حجب مملوكة لتقليل التفاعلات غير النوعية لمحلول غسل المقايسة. قم بتحضير محلول PBS مع 1%BSA بأس هيدروجيني pH 7.4 لإزالة الجسيمات. قم بترشيح المحلول المنظم عبر وحدة ترشيح علوية للزجاجات بحجم 0.2 micron في حاويات معقمة ومصنفة باستخدام محلول غسل المقايسة.

قم بتحضير تركيزات مضاعفة (2x) من أجسام مضادة لنوع معين مُوسومة بالبيوتين (biotinylated antis species)، سواء كانت IGG أو BAG، وstrep AVID وFICO erything أو SPE، والتي ستُستخدم لوسم معقدات المستضد والأجسام المضادة المتكونة خلال خطوة تحضين المصل المختبر. لتحضير العينات، قم بتجهيز المواد والمستهلكات التالية: ماصات دقيقة (micropipets) متعددة والقناة الواحدة مع الرؤوس الخاصة بها، وأطباق معايرة دقيقة (microtiter plates) ذات 96 بئراً ومنخفضة الارتباط بالبروتين لتخفيف البروتين. بعد جمع عينات الدم وعزل المصل، قم برج المصل بجهاز الـ vortex لفترة وجيزة قبل تخفيف العينات في المخفف الأولي داخل طبق معايرة دقيقة ذو 96 بئراً لضمان تفريغ الآبار بشكل سليم وموحد. قم بترطيب كل بئر من بئر اختبار الـ 96 بئراً باستخدام محلول غسيل المقايسة (assay wash buffer)، ثم اسحب المحلول ببطء طوال فترة المقايسة.

يجب أن تستغرق عملية الشفط من خمس إلى 10 ثوانٍ لمنع تكتل الخرزات وانضغاطها داخل غشاء المرشح، حيث يمكن لكلا الأمرين أن يؤديا إلى إبطاء أوقات القراءة في نهاية المقايسة. تحقق من توقف تصريف السائل عن طريق تجفيف الجانب السفلي من لوحة الاختبار باستخدام مناشف ورقية. ومن المهم تجفيف لوحة الاختبار بعد كل خطوة غسيل لمنع تسرب السوائل من الآبار أثناء الحضانة.

لتحضير الخرزات، ابدأ برجّ معلق الخرزات المقترنة المخزون باستخدام جهاز الـ vortex. بعد ذلك، قم بتعرضها للموجات فوق الصوتية لفترة وجيزة في حمام مائي. من الضروري إعادة تعليق الخرزات بشكل صحيح لمنع تكون تكتلات من الخرزات المتجمعة، مما قد يؤدي إلى زيادة وقت القراءة.

بعد ذلك، قم بتوزيع المعلق المركز بمقدار 20 x إلى محلول خرزات عامل بمقدار 2 x في المخفف الأولي. ثم وزع 50 microliters من معلق الخرزات بمقدار 2 x في كل بئر اختبار من لوحة الاختبار المبللة مسبقاً. استعمل الماصة لنقل 50 microliters من كل مصل اختبار ومصل ضابط بمقدار 2 x إلى لوحة الاختبار وفقاً لمخطط لوحة محدد مسبقاً.

أحكم إغلاق غطاء الطبق. غطِّ الطبق بورق الألمنيوم ثم حضّن طبق الاختبار لمدة 60 minutes على هزاز مداري في درجة حرارة الغرفة لتجنب تبخر المحاليل الذي قد يعيق نجاح المقايسة. حافظ على غطاء الطبق مغطىً لطبق الاختبار خلال جميع خطوات التحضين.

بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون سرعة الرج أكبر من 400 وأقل من 700 RPMs لضمان بقاء الخرزات في حالة تعليق، مما يسمح للأجسام المضادة في المصل بالوصول إلى جميع أسطح المستضدات المقترنة. بعد غسل اللوحة في حضنات متتالية للخرزات باستخدام BAG وSPE، اغسل العينات مرة أخرى. ثم أعد تعليق الخرزات بإضافة 125 microliters من محلول المقايسة، ومحلول الغسيل، والمحلول المنظم، والرج لمدة دقيقتين لقراءة اللوحة.

ضع العينة في قارئ المقايسة خلال 10 دقائق من إعادة تعليق الخرزات؛ حيث تمر الخرزات واحدة تلو الأخرى عبر كاشف تتعرض فيه لليزرين. يقوم أحد الليزرين باستثارة الأصباغ الداخلية التي تحدد مجموعة ألوان الخرزات، بينما يقوم الليزر الآخر باستثارة صبغة مراسل FICO erything. يتم تسجيل شدة فلورة FICO erything لعدد محدد مسبقاً من الخرزات كقيمة FM FI؛ اقرأ البئر الأول للتحقق من أن لوحة الخرزات المختارة تتطابق مع ملف تعريف الخرزات في آبار الاختبار.

إذا سقطت الخرزات خارج المنطقة المخصصة لها في شاشة عرض البروتوكول، فهذا يعني أنه تم اختيار ملف تعريف غير صحيح. الخرزات التي تمت إعادة تعليقها بشكل صحيح ستملأ مناطقها المحددة كما هو موضح في برنامج قارئ المقايسة. أما إذا كانت الخرزات متكتلة، فستملأ مناطقها بمعدل بطيء.

يمكنك إخراج لوحة الاختبار من القارئ وإعادة تعليق العينات في الآبار يدويًا لفصل الخرزات. أخرج لوحة الاختبار من القارئ، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بمزج كل بئر من ثلاث إلى أربع مرات. بعد ذلك، أعد لوحة الاختبار إلى القارئ وتابع فحص النتائج.

يجب الإبلاغ عن الأخطاء مثل أعداد الخرزات غير الكافية أو انخفاض درجات خرزات IgG anti IgG، وإعادة المقايسة لهذه العينات. بعد تصدير البيانات إلى برنامج Excel وحساب صافي MFI، يتم تحديد ما إذا كانت أي من ضوابط المقايسة قد فشلت، باستثناء المصل المناعي ذو النطاق العالي. تُعتبر أي ضوابط فاشلة غير مقبولة ويجب إعادة إجراء المقايسة.

يمثل هذا الجدول بيانات مصل الاختبار وضوابط المقايسة من لوحة مقايسة نموذجية. وقد اجتازت جميع ضوابط IgG. وتشير نتائج الاختبار لهذه اللوحة إلى فشل العديد من عينات التفاعل النسيجي وعينات ضابط IgG كما هو موضح في الآبار البرتقالية.

يشير كل من A1C 1 و F1 إلى فشل في تفاعل أنسجة TC، حيث يتم تمثيل درجة TC بين قوسين، بينما يوضح Wells B 1 و E 1 نوعين من حالات فشل الضابط الداخلي لـ IgG، وهما نقص في الجسم المضاد للفحص أو في كواشف الفحص، وذلك في حالتي BAG أو SPE على التوالي. لا يتم تفسير نتائج لوحة الفحص إلا إذا استوفى ضابط ملاءمة النظام وضابط المصل معايير القبول الموضحة هنا. يمكن أن تُظهر الكريات المجهرية المغلفة بـ immunoglobulin مضاد لمصل الفحص خاص بالنوع درجات فشل نتيجة لإضافة عينة غير كافية، أو تخفيف عالٍ جداً للعينة، أو نوع غير صحيح، أو اختبار مصل من مضيف يعاني من نقص المناعة.

إذا كانت نتائج ضوابط مقايسة الاختبار التجريبي مرضية، يتم تصنيف درجات المقايسات الفردية وفقاً لما يلي. وبعد اتباع هذا الإجراء، ينبغي استخدام طرق إضافية مثل ELISA أو IFA أو Western blot لتأكيد النتائج الإيجابية أو غير المتوقعة الأولية. ومن الضروري التحقق من هذه النتائج قبل اتخاذ أي قرار بشأن إدارة الحيوانات.

يمكن القيام بذلك باستخدام منهجيات مختلفة على العينة نفسها أو عينات إضافية من المستعمرة ذاتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء المقايسة المناعية الفلورية المتعددة، وكيفية تفسير النتائج التي يتم الحصول عليها في منشأتك. سيمكنك ذلك من تقليل الجهد المبذول مع جمع المزيد من المعلومات من كل بئر من عينات الاختبار.