اختبار المقايسة المناعية المضاعفة فلوروميتريك المنهجية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن الأجسام المضادة ضد العوامل المعدية العرضية في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان مصل الاختبار باستخدام كريات مجهرية مطلية بالمستضد. بعد ذلك ، يتم تحضين المصل بمضاد للجلوبولين المناعي الخاص بالأنواع الموسومة بيوتينيل ، والذي يكتشف أي مجمعات مناعية للأجسام المضادة للمستضد.

ثم يضاف محلول قوة الستربتافيدين المسمى FICO eryn Fluor من أجل الكشف عن أي نتائج للجلوبولين المناعي البيوتينيل تظهر حالة الأجسام المضادة الإيجابية أو السلبية للعوامل الشائعة في القوارض المختبرية بناء على التألق المتعدد ، ودرجة صافي المقايسة المناعية ، وقيم عينة الفلورسنت. الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية على الطريقة الحالية مثل إليزا ، هي أن MFIA عبارة عن اختبار متعدد الإرسال. يتيح ذلك للباحث فحص ما يصل إلى مائة اختبار مختلف في اختبار واحد.

حسنا ، تقلل هذه التقنية من كمية مناطق المصل والمستهلكات المستخدمة في الطرق الحالية مع زيادة كمية المعلومات الناتجة عن اختبار واحد. حسنا ، خطرنا لأول مرة فكرة استخدام هذه الطريقة عندما كنا نختبر عددا كبيرا من عينات Sera لعوامل متعددة وأردنا تقليل المخاض بالإضافة إلى وقت الاختبار. سيتم توضيح الإجراء دونا كوهين ، أحد كبار التقنيين في مختبرنا للبدء ، قم بتجهيز اثنين من المخازن المؤقتة المطلوبة لتعدد الإرسال أو التألق أو المقايسة المناعية أو إجراء MFIA.

الأول هو مخفف أساسي ، وهو متاح من نهر تشارلز ويحتوي على عوامل حجب خاصة لتقليل التفاعلات غير المحددة لمخزن غسيل الفحص. قم بإعداد محلول PBS مع 1٪ BSA pH 7.4 لإزالة الجسيمات. قم بتصفية المخزن المؤقت من خلال وحدة علوية للزجاجة 0.2 ميكرون في حاويات معقمة تحمل علامات تجارية باستخدام مخزن غسيل الفحص.

قم بإعداد تركيزين x من الأنواع المضادة للبيوتينيل ، IGG أو BAG و STREP AVID و FICO erything أو SPE ، والتي سيتم استخدامها لتسمية مجمعات الأجسام المضادة للمستضد التي تشكلت أثناء خطوة حضانة مصل الاختبار لإعداد عينات من المواد التالية والمستهلكات المجمعة متعددة القنوات وحيدة القناة ونصائح ، و 96 لوحة ميكروتيتر ملزمة منخفضة البروتين لتخفيف البروتين. بعد جمع عينات الدم وعزل دوامة المصل لفترة وجيزة قبل تخفيف العينات في المخفف الأولي في صفيحة ميكروتيتر 96 بئر لضمان إخلاء جيد وموحد قبل الرطب. كل بئر من لوحة اختبار 96 جيدا مع مخزن غسيل الفحص يستنشق المحلول ببطء في جميع أنحاء الفحص.

يجب أن يستغرق الشفط من خمس إلى 10 ثوان لمنع تراكم الخرزات وضغط الخرز في غشاء المرشح ، وكلاهما يمكن أن يبطئ أوقات القراءة في نهاية الفحص. تحقق من توقف تصريف السوائل عن طريق نشاف الجانب السفلي من لوحة الاختبار بالمناشف الورقية. من المهم مسح لوحة الاختبار بعد كل خطوة غسيل لمنع فتل الآبار أثناء الحضانة.

لتحضير الخرز ، ابدأ بتدوير تعليق الخرزة المقترن بالمخزون. ثم صوتنة لهم لفترة وجيزة في الحمام. من الأهمية بمكان إعادة تعليق الخرزات بشكل صحيح لمنع مجموعات الخرز المجمعة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى أوقات قراءة أطول.

بعد ذلك ، قم بتوزيع تعليق المخزون 20 × إلى محلول حبة عمل اثنين في المخفف الأساسي. ثم قم بتوزيع 50 ميكرولترا من تعليق حبة x في كل بئر فحص من لوحة الاختبار المبللة مسبقا. ماصة 50 ميكرولتر من كل مصل اختبار وتحكم اثنين إلى لوحة الاختبار بناء على خريطة لوحة محددة مسبقا.

ثبت الغطاء على اللوحة. قم بتغطيته بورق الألمنيوم واحتضان لوحة الاختبار لمدة 60 دقيقة على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة لتجنب تبخر المحاليل التي يمكن أن تمنع نجاح الفحص. احتفظ بلوحة الاختبار مغطاة بغطاء اللوحة أثناء جميع خطوات الحضانة.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون اهتزاز السرعة أكبر من 400 ، ولكن أقل من 700 دورة في الدقيقة بحيث تظل الخرزات معلقة للسماح للأجسام المضادة في الدم بالوصول إلى جميع أسطح المستضدات المقترنة. بعد غسل اللوحة في حضانات متسلسلة من الخرز باستخدام BAG و SPE ، اغسل العينات مرة أخرى. ثم قم بتعليق الخرزات بإضافة 125 ميكرولتر من الفحص ، واغسلها ، وتخزينها مؤقتا ، ورجها لمدة دقيقتين لقراءة اللوحة.

ضعه في قارئ الفحص في غضون 10 دقائق من تعليق الخرزات ، تمر الخرزات واحدة تلو الأخرى عبر كاشف حيث تتعرض لليزرين. يثير أحد الليزرات الأصباغ الداخلية التي تحدد مجموعة ألوان الخرز والآخر يثير صبغة مراسل FICO erything. يتم الإبلاغ عن شدة مضان FICO لعدد محدد مسبقا من الخرزات حيث قرأت FM FI البئر الأول للتحقق من أن لوحة الخرزة المحددة تتطابق مع ملف تعريف الخرزة في آبار الاختبار.

إذا كانت هناك حبات تقع خارج منطقة الخرزة المخصصة لها على شاشة البروتوكول ، فقد تم إجراء تحديد ملف تعريف غير صحيح. ستملأ الخرزات التي تم تعليقها بشكل صحيح مناطقها المحددة كما هو موضح في برنامج قارئ الفحص. إذا تم تجميع الخرزات ، فسوف تملأ مناطقها بمعدل بطيء.

يمكنك إزالة لوحة الاختبار من القارئ وإعادة تعليق الآبار يدويا لفصل الخرز. قم بإزالة لوحة الاختبار من القارئ واستخدم معدل ثلاثي الماصة متعدد القنوات لكل بئر ثلاث إلى أربع مرات. ثم أعد لوحة الاختبار إلى القارئ واستمر في فحص النتائج.

أبلغ عن أخطاء مثل عدم كفاية عدد الخرزات أو انخفاض درجات حبة IgG المضادة ل IgG ، وكرر الاختبار لهذه العينات. بعد تصدير البيانات إلى Excel وحساب صافي MFI ، حدد ما إذا كان أي من عناصر التحكم في اختبار تشغيل التشغيل باستثناء المصل المناعي عالي المدى. أي عناصر تحكم فاشلة غير مقبولة ويجب تكرار الفحص.

يمثل هذا الجدول بيانات لاختبار مصل الدم وعناصر التحكم في الفحص من لوحة فحص نموذجية. هل تم تمرير جميع عناصر تحكم IgG. تشير نتائج اختبار هذه المسرحية إلى أن العديد من عينات التحكم في تفاعل الأنسجة و IgG فشلت كما هو موضح في الآبار البرتقالية.

يشير A1C one و F1 إلى فشل تفاعلي في أنسجة TC حيث يتم تمثيل درجة TC بين قوسين ، توضح Wells B one و E واحدة نوعين من فشل التحكم الداخلي IgG ، أو عدم كفاية الأجسام المضادة للاختبار أو كواشف الاختبار ، BAG أو SPE على التوالي. لا يتم تفسير نتائج لوحة الاختبار إلا إذا كان التحكم في ملاءمة النظام والتحكم في المصل يستوفيان معايير القبول الموضحة هنا. يمكن أن تظهر الكريات المجهرية المغلفة بأنواع خاصة بمضاد للاختبار في مصل الغلوبولين المناعي درجات الفشل بسبب إضافة عينة غير كافية عالية جدا ، أو تخفيف العينة ، أو الأنواع غير الصحيحة ، أو اختبار المصل من مضيف يعاني من نقص المناعة.

إذا كانت نتائج التحكم في اختبار اللعب مرضية ، يتم تصنيف درجات الفحص الفردية وفقا لما يلي. باتباع هذا الإجراء ، يجب أن نستخدم طرقا إضافية مثل Eliza و IFA و / أو اللطخة الغربية لتأكيد النتائج الأولية غير المتوقعة أو الإيجابية. من الأهمية بمكان التحقق من هذه النتائج قبل اتخاذ أي قرار بشأن إدارة.

يمكن القيام بذلك باستخدام منهجيات مختلفة على نفس العينة أو عينات إضافية من نفس المستعمرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفلورو متعدد الإرسال ، والمقايسة المناعية المترية ، وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها في منشأتك. سيمكنك ذلك من تقليل المخاض مع جمع المزيد من المعلومات من كل عينة اختبار جيدا.